本发明专利技术公开了一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法：(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，眼眶采血，血样离心分离血浆；(2)微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3～3.5；涡旋混匀后离心，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，离心，取上清作为样品待测；(3)采用高效液相色谱‑三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，采用p‑MRM‑IDA‑EPI模式来分析代谢产物。本发明专利技术通过质谱采用p‑MRM方法结合软件快速鉴定分析，对血浆中各个成分变化及结构改变等代谢变化跟踪，结果发现羟基红花黄色素A代谢产物11个，完成了羟基红花黄色素A及代谢产物在血浆中的时间变化曲线，并成功推断鉴定了其中羟基红花黄色素A的7个代谢产物及同分异构体的分子结构，比目前采用化学结构分析手段更快速、更灵敏。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物检测分析领域，具体涉及一种检测血样中羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法。
技术介绍
:红花是菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花。红花黄色素(SY)存在于红花的水溶性提取部位，被认为是红花的主要效应物质，其中羟基红花黄色素A(HSYA)含量较高，是发挥药理作用的有效单体成分，具有抑制二磷酸腺苷(ADP)或胶原诱导的血小板聚集作用，有防止血栓的形成和发展或促进血栓溶解作用。谷红注射液(国药准字H22026638)为乙酰谷酰胺和红花提取物制成的灭菌水溶液，是临床常用的中西结合制剂，具有活血化瘀，通脉舒络功效，临床用于瘀血闭阻所致的胸痹、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性脑病、脑血栓及肺心病所致血瘀诸证。药物进入生物体内经历吸收、分布、生物转化和排泄等过程。药物被机体吸收后，在机体作用下，通过氧化、还原、水解(Ⅰ相代谢)和结合(Ⅱ相代谢)代谢反应，发生化学结构转化，药物对机体作用的结果是机体反应的表现即药效，目前对谷红注射液、红花等的体内研究，主要选择代表成分羟基红花黄色素A(HSYA)在体内的药物浓度的动态变化，绘制药时浓度曲线，开展体内药物代谢研究，但均没有对药物进入体内后的代谢产物及途径开展深入研究。了解羟基红花黄色素A的代谢产物和途径对于羟基红花黄色素A的临床运用具有重要意义。
技术实现思路
:本专利技术的目的是提供一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法，具体采用“杆-阱”扫描IDA工作模式在一针进样中同时完成谷红注射液的代谢物的检测方法。pMRM-IDA-EPI是检测目标性低含量代谢物最灵敏有效的方式，可同时定性定量，可以选择性的全面覆盖具有特征碎裂规律化合物的代谢转化形式。MIM-IDA-EPI可以对高含量的代谢物，不符合经典碎裂规律的代谢物进行高通量的筛查。LightSightTM软件可以辅助建立多种灵活的IDA方法，简化数据处理。本专利技术采用的技术方案如下：一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，注射量为10～15mg/kg，在5min～8h内眼眶采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3～3.5；涡旋混匀后离心，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，离心，取上清作为样品待测；(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：a、色谱条件：Shimadzu20ADXR流动相A:2mM乙酸铵的水溶液流动相B:乙腈、水体积比90:10，含2mM乙酸铵色谱柱及洗脱方式：PoroShell120EC-C18色谱柱梯度洗脱程序如下表1：表1梯度洗脱中，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％b、质谱条件：ABSCIEXQtrap4500ESINegativeMode负离子模式气帘气CUR:25psi喷雾电压IS:5500V离子源温度TEM:575℃雾化气GS1:60psi辅助加热气GS2:60psi碰撞气CAD:Medium(4)采用p-MRM-IDA-EPI模式来分析代谢产物，其中MRM扫描的IDA阈值为1000cps，EPI扫描速率为10000amu/s，CE为-45eV，DP为-60V，驻留时间10ms；MRM离子对根据羟基红花黄色素A的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。进一步，所述步骤(3)中，PoroShell120EC-C18色谱柱的尺寸为4.6mm×150mm，填料粒径2.7μm。所述步骤(3)中，高效液相色谱的柱温优选40℃，流速优选0.4mL/min。所述步骤(1)中，谷红注射液静脉的注射量优选为12mg/kg。所述步骤(1)中，离心分离血浆优选在4℃下5000r·min-1离心10min，分离得到血浆。所述步骤(2)优选按以下方法操作：微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3；涡旋混匀后，6000r/min离心10min，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，10000r/min离心，取上清作为样品待测。所述步骤(2)更优选按以下方法操作：微量加样器吸取血浆0.3mL，置于1.5mL离心试管中，准确加入0.9mL乙腈，涡旋混匀2min，6000r/min离心10min，取上清0.6mL，氮气吹干，再用0.3mL乙腈溶解，10000r/min离心，取上清作为样品待测。所述步骤(3)中，所述高效液相色谱的进样量为5.0μL。更具体的，优选本专利技术方法按以下步骤操作：(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，注射量为12mg/kg，分别在5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h时间点眼眶采血0.5mL，血样置肝素化离心管中，4℃下5000r·min-1离心10min，分离血浆，-80℃下冰箱冰冻保存待分析；(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆0.3mL，置于1.5mL离心试管中，准确加入0.9mL乙腈，涡旋混匀2min，6000r/min离心10min，取上清0.6mL，氮气吹干，再用0.3mL乙腈溶解，10000r/min离心，取上清作为样品待测；(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：a、色谱条件：Shimadzu20ADXR柱温:40℃流速:0.4mL/min流动相A:2mM乙酸铵的水溶液流动相B:乙腈、水体积比90:10，含2mM乙酸铵色谱柱及洗脱方式：PoroShell120EC-C18色谱柱(4.6mm×150mm，2.7μm)梯度洗脱程序如下表1表1梯度洗脱中，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％b、质谱条件：ABSCIEXQtrap4500ESINegativeMode负离子模式气帘气CUR:25psi喷雾电压IS:5500V离子源温度TEM:575℃雾化气GS1:60psi辅助加热气GS2:60psi碰撞气CAD:Medium(4)采用p-MRM-IDA-EPI模式来分析代谢产物，其中MRM扫描的IDA阈值为1000cps，EPI扫描速率为10000amu/s，CE为-45eV，DP为-60V，驻留时间10ms；MRM离子对根据羟基红花黄色素A的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。在负离子模式下，根据母药二级碎裂的特点，质谱采用p-MRM方法检测。具体的，所述p-MRM-IDA-EPI模式的操作方式是：利用母药的母离子及其特征性的碎片子离子的质荷比，理论预测并创建代谢物的MRM离子对，仪器及软件根据方法设定参数自动进行采集，进行扫描检测，过程包括以pMRM(预测性多元反应监测)作为预扫描，设置相应的IDACriteriaLevel1(IDA一级标准)进行评估，以触发增强型子离子扫描(EPI)。采集当前MRM通道母离子的二级谱图，以及根据当前化合物的强度，以及当前化合物是否在出峰(DBS,动态背景扣除功能)判断，软件自己决定是否要切换到EPI模式。根据软件两个列表，即Includelist和Excludelist.这两个表规定哪些母离子出现是必须采集EPI谱的，而另一些即使符本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，注射量为10～15mg/kg，在5min～8h内眼眶采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3～3.5；涡旋混匀后离心，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，离心，取上清作为样品待测；(3)采用高效液相色谱‑三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：a、色谱条件：Shimadzu 20ADXR流动相A:2mM乙酸铵的水溶液流动相B:乙腈、水体积比90:10，含2mM乙酸铵色谱柱及洗脱方式：PoroShell 120EC‑C18色谱柱梯度洗脱，0～1min，流动相B的体积分数为2％；1～6min，流动相B的体积分数从2％增加到8％；6～12min，流动相B的体积分数从8％增加到100％；12～14min，流动相B的体积分数为100％，14～14.1min，流动相B的体积分数从100％减少到2％，14.1min之后，流动相B的体积分数保持2％；梯度洗脱中，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％；b、质谱条件：AB SCIEX Qtrap 4500ESI Negative Mode负离子模式气帘气CUR:25psi喷雾电压IS:5500V离子源温度TEM:575℃雾化气GS1:60psi辅助加热气GS2:60psi碰撞气CAD:Medium(4)采用p‑MRM‑IDA‑EPI模式来分析代谢产物，其中MRM扫描的IDA阈值为1000cps，EPI扫描速率为10000amu/s，CE为‑45eV，DP为‑60V，驻留时间10ms；MRM离子对根据羟基红花黄色素A的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。...
【技术特征摘要】
1.一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，注射量为10～15mg/kg，在5min～8h内眼眶采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3～3.5；涡旋混匀后离心，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，离心，取上清作为样品待测；(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：a、色谱条件：Shimadzu20ADXR流动相A:2mM乙酸铵的水溶液流动相B:乙腈、水体积比90:10，含2mM乙酸铵色谱柱及洗脱方式：PoroShell120EC-C18色谱柱梯度洗脱，0～1min，流动相B的体积分数为2％；1～6min，流动相B的体积分数从2％增加到8％；6～12min，流动相B的体积分数从8％增加到100％；12～14min，流动相B的体积分数为100％，14～14.1min，流动相B的体积分数从100％减少到2％，14.1min之后，流动相B的体积分数保持2％；梯度洗脱中，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％；b、质谱条件：ABSCIEXQtrap4500ESINegativeMode负离子模式气帘气CUR:25psi喷雾电压IS:5500V离子源温度TEM:575℃雾化气GS1:60psi辅助加热气GS2:60psi碰撞气CAD:Medium(4)采用p-MRM-IDA-EPI模式来分析代谢产物，其中MRM扫描的IDA阈值为1000cps，EPI扫描速率为10000amu/s，CE为-45eV，DP为-60V，驻留时间10ms；MRM离子对根据羟基红花黄色素A的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，PoroShell120EC-C18色谱柱的尺寸为4.6mm×150mm，填料粒径2.7μm。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，高效液相色谱的柱温40℃，流速0.4mL/min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，谷红注射液静脉的注射量为12mg/kg。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，离心分离血浆是在4℃下5000r·min-1离心10min，分离得到血浆。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)按以下方法操作：微量加样器吸取血浆，...
【专利技术属性】
技术研发人员：万嘉洋，张宇燕，丁志山，万海同，黄平，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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