一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种高糖激活的间充质干细胞制备方法，一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其在制备糖尿病药物方面的应用。所述高糖激活的间充质干细胞的制备方法为将分离提取的脐带、骨髓或脂肪间充质干细胞培养至融合达40～50％时，加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液，培养48±2小时，所述间充质干细胞融合达75～80％时，消化、中和、洗涤并收集高糖激活的间充质干细胞。所述高糖激活的间充质干细胞注射液包括高糖激活的间充质干细胞、人血白蛋白、复方维生素、甘露醇、葡萄糖和生理盐水。所述高糖激活的间充质干细胞注射液可用于治疗2型糖尿病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，尤其涉及一种高糖激活的间充质干细胞的制备，一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用。
技术介绍
随着现代生活方式的改变，糖尿病的发病率越来越高，新近中国的一项调查研究发现，中国的糖尿病发病率近10％，即发病人口已经接近1亿，其中，95％是2型糖尿病(T2D)。T2D的发病机制是肥胖导致的慢性炎症而致的胰岛素抵抗，造成高血糖、以及持续的高血糖并进而导致的糖代谢与脂代谢紊乱，从而对胰岛beta细胞造成进行性损伤。因此，T2D的治疗包括两个方面的措施：一方面是使用降糖药物与胰岛素增敏剂改善高血糖状态，另一方面是使用外源的胰岛素以补充胰岛功能下降而引起的胰岛素分泌的不足。然而，目前的治疗方案尽管很多，仍然无法完全实现稳定控制血糖，引起胰岛功能不断的损毁，最后导致心脑血管、神经等系统并发症的出现。因此，寻找更好的治疗方法志在必行。间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员，因其具有多向分化潜能、自我更新能力，以及分泌多种因子参与损伤的组织与器官的修复与再生而被广泛应用于多种疾病的治疗。MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞，除此之外，MSCs还具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能逃避免疫识别、抑制免疫应答，这就为同种异体使用提供基础。先前的研究证实，MSCs在特定条件下可以诱导分化为胰岛beta细胞，这为治疗糖尿病带来希望。越来越多的研究证实MSCs通过分泌的细胞因子可发挥免疫调节与降低炎症的作用。由于MSCs是原始的修复细胞，生理状态下处于静止状态，当机体的稳态发生改变，它以非对称分裂的模式复制子代细胞处于修复再生以恢复机体稳态，即MSCs发挥作用的触发因素取决于其周围环境，环境因素负反馈触发MSCs的反应机制，产生修复与再生。T2D起源于肥胖导致体内慢性炎症的发生，长期的慢性炎症诱发的细胞对胰岛素的吸收存在障碍，也就是胰岛素抵抗，抵抗的持续，严重影响了细胞对糖的吸收，出现高血糖。前期的研究证实MSCs输注明显改善了T2D大鼠外周靶组织对胰岛素的抵抗，促进了细胞对葡萄糖的吸收。然而，目前的MSCs，无论来源于脐带，还是自体骨髓或脂肪组织，均不是特异修复T2D的，这在很大程度上限制了MSCs的治疗效果。前期的文献报道，无论临床试验还是动物实验，用MSCs的输注治疗T2D均无法使高血糖恢复至正常水平，且经过一定的时间后血糖又有不同程度的升高。基于上述问题，本专利技术进行研究，对MSCs进行处理，得到一种高糖负反馈调节激活了的间充质干细胞注射液，用于输注治疗T2D。
技术实现思路
针对通用型的间充质干细胞(MSCs)输注液治疗2型糖尿病(T2D)存在效率不高的问题，本专利技术提供了一种高糖激活的间充质干细胞制备方法，一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其制备方法和在用于糖尿病药物中应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现：一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为：a)将分离提取的间充质干细胞在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞；b)在步骤a)的所述单层细胞中加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液；c)培养所述单层细胞融合达75～80％时，移去培养上清液，用胰蛋白酶-EDTA37℃消化1min，所述间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶-EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50mL无菌离心管；d)加入无菌生理盐水，1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。进一步的，所述步骤b)中加入终浓度为20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液。进一步的，所述步骤c)中所述单层细胞融合达75～80％，所用培养时间为48±2小时。进一步的，所述步骤d)中，加入50mL生理盐水，测定的高糖激活的间充质干细胞的浓度为5×105～2×106。所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95％以上。一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为5×105～2×106个/mL的高糖激活的间充质干细胞、质量体积比为1～5％的人血白蛋白、质量体积比为1～5％的复方维生素、质量体积比为1～8％的甘露醇、质量体积比为0.5～2.5％的葡萄糖和余量的生理盐水。对上述技术方案的进一步改进，所述高糖激活的间充质干细胞注射剂中所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞时加入终浓度为20～50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养48±2小时的间充质干细胞。进一步的，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞时加入终浓度20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养48±2小时的间充质干细胞。所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95％以上。一种高糖激活的间充质干细胞注射液的制备方法，其包括a)预先制备人血白蛋白、甘露醇注射液、复方维生素注射液和葡萄糖注射液，并4℃预冷备用；b)按照质量体积比配制人血白蛋白、甘露醇注射液、复方维生素注射液和葡萄糖注射液；c)将高糖激活的间充质干细胞重悬于步骤b)所述的注射液中，并加入余量的生理盐水。上述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。所述干细胞注射液采用单次或多次输注的方案，且在所述间充质干细胞注射液在2小时内使用完毕。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是：本专利技术采用人脐带、骨髓、脂肪组织的间充质干细胞，采用高糖浓度进行培养预处理，激活干细胞负反馈调节机制，明显增强了间充质干细胞发挥抗T2D的效应，改善了胰岛素抵抗，并促进胰岛beta细胞功能恢复。本专利技术制备的激活的间充质干细胞，经过简单的预处理，干细胞特性未见变化，本制备体系易于质量控制，易于产业化。本专利技术采用激活的间充质干细胞注射液优化治疗方案，采用多次输注治疗的策略，显著降低了T2D的胰岛素抵抗，并修复损伤的胰岛beta细胞，恢复糖尿病患者的胰岛功能。通过本专利技术提供了技术方案，明显提高了MSCs输注治疗T2D的效率，使得T2D的高血糖及胰岛素抵抗恢复到接近正常水平，使糖尿病患者达到摆脱胰岛素注射。附图说明：图1.正常大鼠和实施例5试验治疗组大鼠血糖浓度变化图。横坐标前面的0、3、7表示链脲佐菌素(STZ)处理MSC的时间，后面的7/14/21/28/35指MSC治疗后的时间；Normal指正常大鼠，T2D指2型糖尿病大鼠并采用空白治疗组，T2D+MSCs指2型糖尿病大鼠并采用未处理脐带间充质干细胞治疗组，T2D+激活MSCs指2型糖尿病大鼠并采用高糖激活的脐带间充质干细胞治疗组。图2.正常大鼠和实施例5试验治疗组大鼠胰岛素抵抗指数(IR指数)比较图。图3.T2D大鼠和间充质干细胞治疗组大鼠胰岛病理切片比较图。图4.正常大鼠和实施例6试验治疗组大鼠血糖浓度变化图。横坐标前面的0、3、7表示STZ处理MSC的时间，后面的7/14/21/28/35指MSC治疗后的时间；No本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为：a)将分离提取的间充质干细胞在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞；b)在步骤a)所述的单层细胞中加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液；c)培养所述单层细胞融合达75～80％时，移去培养上清液，用胰蛋白酶‑EDTA 37℃消化1min，所述间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶‑EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50mL无菌离心管；d)加入无菌生理盐水，1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为：a)将分离提取的间充质干细胞在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞；b)在步骤a)所述的单层细胞中加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液；c)培养所述单层细胞融合达75～80％时，移去培养上清液，用胰蛋白酶-EDTA37℃消化1min，所述间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶-EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50mL无菌离心管；d)加入无菌生理盐水，1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤b)中加入终浓度为20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液。3.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤c)中所述单层细胞融合达75～80％，所用培养时间为48±2小时。4.一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为5×105～2×106个/mL的高糖激活的间充质干细胞、质量体积比为1～5％的人血白蛋白、质量体积比为1～5％的复方维生素、质量体积比为1～8％的甘露醇、质量体积比为0.5～2....

【专利技术属性】
技术研发人员：郝好杰，李梓源，
申请(专利权)人：北京恒峰铭成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11