一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。该试剂盒灵敏度为10pg/L，线性范围为40～1000pg/L，测耗时短，无需特殊仪器设备和专业技术人员，可满足医院、海关、卫生检疫部门等单位对产气荚膜梭菌进行快速检测的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫应用领域，涉及医疗机构、防疫检疫部门等单位诊断或检测产气荚膜梭菌的技术，具体涉及一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用。
技术介绍
产气荚膜梭菌(C.perfringens)，曾称魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌，是人类气性坏疽的主要病原菌。1892年，美国病理学家W.H.Welch等自一尸体分出本菌，因而又称魏氏梭菌。根据产生毒素种类和致病性的不同，本菌有A～F6个型，其中，有些菌株产生肠毒素，可引起食物中毒。本菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，常因深部创伤而感染。此外，产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎。目前，针对产气荚膜梭菌的检测方法主要包括：厌氧菌培养、细菌生化特性鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等，这些方法有的耗费时间长，有的条件要求高，有的受外界因素影响较大而削弱了其实用价值，在临床检测方面受到了很大的限制。因此，研究快速检测产气荚膜梭菌的诊断试剂，以便对气性坏疽感染进行现场检测和及时监控。免疫层析是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方法，由于广泛使用胶体金作为指示剂，所以又被称为胶体金检测法。目前该方法广泛应用于样品初筛，但缺点是检测灵敏度较低，难以进行定量检测。荧光定量免疫层析技术是免疫荧光技术和传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术，该技术在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速等优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量。荧光定量免疫层析产品以功能化纳米微球载体技术，结合荧光标记物探针，仪器直接检测激发荧光信号而非传统金标定量所采用的CCD表层光密度扫描技术，因此具有较高的信噪比、更高的信号检测量和检测灵敏度。但是，荧光信号强度与荧光微球数量呈直线相关，荧光微球数量需要达到一定量才会具有较好的效果，因此，急需开发出一种无需太多荧光微球，也能有很好效果的荧光定量免疫层析技术，用于产气荚膜梭菌的检测。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于：(1)提供一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒；(2)一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。进一步，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的浓度为1～2g/L；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的浓度为1～2g/L；所述质控线上山羊抗兔IgG的浓度为1～2g/L。进一步，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的喷量为1～2μl/cm；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的喷量为1～2μl/cm；所述质控线上山羊抗兔IgG的喷量为1～2μl/cm。进一步，所述荧光微球为已羧基化的聚苯乙烯荧光微球。进一步，所述荧光免疫层析检测装置还包括一卡壳，所述卡壳包括面板和底板，所述试纸条位于所述面板和底板之间，所述面板上设置有加样孔和检测孔，所述加样孔和检测孔位置分别与所述试纸条上试剂垫和硝酸纤维素膜位置对应。进一步，所述样品稀释液由以下方法制得：(1)纳米银溶液的制备：将硝酸银加入去离子水中，煮沸后分次加入柠檬酸三钠，搅拌至最后一次加入的柠檬酸三钠溶解后再煮沸1min，冷却至25℃后，定容至溶液中纳米银浓度为1～2mmol/L；(2)样品稀释液的制备：向含有表面活性剂的缓冲液中加入步骤(1)中制得的纳米银溶液，定容至溶液中纳米银浓度为0.1～0.2mmol/L。进一步，步骤(1)中，所述硝酸银与每次加入的柠檬酸三钠的质量比为1:2～1:5；所述分次为每隔1min加入一次，共3次。进一步，步骤(2)中，所述表面活性剂为吐温-20，所述吐温-20的质量分数为1～2％；所述缓冲液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH值为6.8～7.4。2、一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌的方法，其中，所述试剂盒为上述的试剂盒；所述方法具体为：将样品与所述试剂盒中样品稀释液混合后，加入所述试剂盒中荧光免疫层析检测装置中进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。进一步，所述样品与样品稀释液的体积比为1:10～1:15。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒及其应用，通过确定兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球浓度及喷量、兔抗产气荚膜梭菌IgG浓度及喷量、山羊抗兔IgG浓度及喷量，组装制备了产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测装置，采用了免疫荧光定量检测技术和纳米银表面等离子荧光增强技术，以该荧光免疫层析检测装置配合本专利技术中制备的含有纳米银的样品稀释液，用于产气荚膜梭菌的定量检测，具有以下优点：(1)灵敏度高，可达到10pg/L(以产气荚膜梭菌菌体抗原计)；(2)线性范围宽，可达到40～1000pg/L；(3)特异性强，运用该方法以破伤风杆菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，普通变形杆菌，粪肠球菌6种菌做对照，其中所有菌均采用标准菌株培养、菌体抗原提取、调整菌体抗原浓度为100～200pg/L，以试剂本底做阴性对照，其荧光强度<100AU，结果显示产气荚膜梭菌荧光强度为1500AU左右，为阳性结果，其他6种菌的荧光强度均为100AU左右，为阴性结果，表明本试纸条具有很好的特异性；(4)该方法测耗时短，仅需10～15min，检测操作简便，无需特殊仪器设备和专业技术人员，可以满足医院、海关、卫生检疫部门等单位对产气荚膜梭菌进行快速检测的需要。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为产气荚膜梭菌荧光免疫层析试纸条的组装示意图；图2为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡示意图；图3为产气荚膜试剂荧光免疫法的检测原理图；图4为纳米银溶液的透射电镜图；图5为纳米银颗粒的荧光增强性能分析图；图6为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒的灵敏度测试图；图7为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒的线性范围测试图；图8为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒的特异性测试图；具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。材料及试剂：聚苯乙烯荧光微球(货号：L050L)，购于广州万孚生物技术公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、牛血清白蛋白、吐温-20，海藻糖、硝酸银，购于美国Sigma-Aldrich公司；聚酯纤维膜，购于南京微测生物科技公司；柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，购于西亚试剂公司；兔抗产气荚膜梭菌IgG(货号本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。2.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的浓度为1～2g/L；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的浓度为1～2g/L；所述质控线上山羊抗兔IgG的浓度为1～2g/L。3.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的喷量为1～2μl/cm；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的喷量为1～2μl/cm；所述质控线上山羊抗兔IgG的喷量为1～2μl/cm。4.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为已羧基化的聚苯乙烯荧光微球。5.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析检测装置还包括一卡壳，所述卡壳包括面板和底板，所述试纸条位于所述面板和底板之间，所述面板上设置有加样孔和检测孔，所述加样孔和检测孔位置分别与所述试纸条上试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋栋能，蒲晓允，余鹃春，黄德智，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50