一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法技术

本发明专利技术公开了一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法，通过调整发酵培养基初始葡萄糖浓度在20-60g/L；当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期后3-5h或pH触底反弹回升0.2-0.3以后，控制葡萄糖浓度在接近于0-3.9g/L的低水平，维持ABE厌氧发酵条件直至发酵结束。使用本发明专利技术提供的方法，可以调节丙酮/丁醇比为0.6-1.02之间、丙酮浓度7.34g/L-11.74g/L在之间，最大丙酮浓度和丙酮/丁醇比是所见研究报道和相关专利的最高水平，为实现利用生物质原料替代化石原料合成丙酮、自由调控ABE发酵的丙酮/丁醇比、实现ABE发酵产品的多样化提供了参考，对ABE发酵具有重要指导意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高和自由控制ABE发酵丙酮/丁醇比的方法，尤其是利用丙丁梭菌生产丙酮和丁醇、强化生物丙酮合成的新型发酵方法，属于生物

技术介绍
丁醇和丙酮都是重要的平台化合物，在化工、塑料、医药、有机合成、涂料和印染等行业具有广泛用途。同时，生物丁醇是一种极具潜力、清洁可再生的新型液态燃料，可作为化石燃料的替代品；而丙酮则是优良的柴油助燃剂，它可以提高柴油的燃烧性能、减少有害气体(NOX、SOX等)的排放，环境效益明显(WuH,NithyanandanK,ZhangJ,etal.Impactsofacetone-butanol-ethanol(ABE)ratioonsprayandcombustioncharacteristicsofABE-dieselblends.Appl.Energy,2015,149:367-378)。发展生物燃料和高效燃料添加剂已成为世界各国应对能源危机、减少温室气体排放、改善气候环境的重要措施。丙酮-丁醇-丁醇发酵也称为ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)发酵，其主产品是丁醇，丙酮是主要副产品，发酵产物中的丁醇/丙酮/乙醇的摩尔比率大约为6:3:1(质量比约为67:26:7)。目前，人们更为看中的是丁醇发酵生产，几乎所有研究都集中在高效生产丁醇、抑制丙酮合成，增加丁醇在总溶剂中所占有的比率(等同于降低丙酮/丁醇比)，提高原料对丁醇的转化率等方面。2014年，我国丙酮消费量达130万吨，年增加率逾10％。目前，由于没有专一性发酵生产丙酮的微生物菌株，丙酮基本上完全(90％以上)依靠不可再生的、化石原料合成生产，其可持续发展和碳排放存在很大问题。ABE发酵可以生产少量丙酮，但是，多年来，丙酮生物合成并不受重视。其原因在于：1)发酵浓度太低(一般只有5g/L左右)；2)与主产品(丁醇)抢夺发酵原料、降低原料的目标转化率。但是，即便丙酮发酵浓度很低，它毕竟也是一个副产品、而不能简单地抛弃，其产量仍旧要统计到ABE发酵的原料利用报表中去。目前，发酵法生产丙酮仍利用传统丙丁发酵菌种(丙丁梭菌、拜式梭菌、糖型梭菌等)进行，生产效率低。生命周期评价(lifecycleassessment，LCA)法是一种对多重产品生产过程进行经济评价的有效方法。它通过对某一过程的产品多样性、产品价格、温室气体排放，以及生产原料的物性和能量特征进行评估，找出过程经济性、环境效益和产品多样性的最佳切入点，从而实现生产过程性能的整体最优。有研究报道指出，ABE发酵的LCA和经济性依赖于将丙酮作为重要平台化合物和高效清洁燃料添加剂的评价(KA,RühlJ,BlankLM,etal.Integrationofbiocatalystandprocessengineeringforsustainableandefficientn-butanolproduction.Eng.LifeSci.,2015,15:4-19)。实际上，侧重LCA的ABE发酵实际上等同于同时强化丙酮和丁醇的合成、并最大可能地提高丙酮/丁醇质量比。传统丙丁梭菌实际上也具备高产丙酮的能力。但是，由于ABE发酵存在严重的丁醇产物抑制，一旦丙丁梭菌间歇式ABE发酵开始，丁醇浓度迅速上升，在较短时间内(40-50h)达到抑制浓度，丙丁梭菌的产丙酮的能力无法得到体现。一般情况下，最终丁醇浓度和丙酮浓度分别停留在12-13g/L和5-6g/L左右的水平。使用高效丁醇原位萃取剂-油醇，选择性地将丁醇萃取到油醇中、控制发酵液相中的丁醇浓度于低水平，发酵液相中的丙酮浓度甚至可以积累到15g/L左右的高水平(数据未公开)。但是，由于高效丁醇原位萃取剂(油醇)价格昂贵、原位萃取体系操作难度大，实用上存在很大问题，现在丁醇和丙酮生物合成的主流依旧是间歇发酵。与丁醇及其合成相比，丙酮及其合成具有截然不同的特征：丙酮合成不需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的参与，对细胞的能量供给压力小；丙酮对细胞的毒害作用小、提高其发酵浓度不会影响溶剂生产效率；丙酮沸点低、蒸馏精制相对容易、精制纯化成本低。因此，从以下几个方面考虑对ABE发酵过程实施调控，提高生物丙酮的生产效率、提高或控制丙酮/丁醇比，从强化丙酮合成的角度改善ABE发酵的总体性能是可行的：1)通过环境胁迫，强化丙丁梭菌(C.acetobutylicum)对于高丁醇浓度环境的耐受能力(LuoHZ,GeLB,ZhangJS,etal.Enhancingbutanolproductionunderthestressenvironmentsofco-culturingClostridiumacetobutylicum/Saccharomycescerevisiaeintegratedwithexogenousbutyrateaddition,PLoSONE,2015,10(10):e0141160)；2)通过适度降低梭菌胞内的NADH再生速度，改变梭菌胞内碳代谢流的分配、使较多的碳流走向丙酮合成途径，降低细胞的能量供给压力、使得ABE发酵以高效的NADH再生模式运转(LuoHZ,GeLB,ZhangJS,etal.Enhancingacetonebiosynthesisandacetone-butanol-ethanolfermentationperformancebyco-culturingClostridiumacetobutylicum/Saccharomycescerevisiaeintegratedwithexogenousacetateaddition.Bioresour.Technol.,2016,200:43-51)；3)控制发酵体系的还原糖浓度于低水平、弱化梭菌糖酵解主路的碳代谢速度，进而限制NADH的生成，为高丙酮/丁醇比率的形成创造条件；4)外添乙酸作为共同碳源、维持胞内乙酸浓度于较高水平，提高催化丙酮合成的辅酶A转移酶(CoAT)的活性(ChenCK,BlaschekHP.EffectofacetateonmolecularandphysiologicalaspectsofClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052solventproductionandstraindegeneration.Appl.Environ.Microbiol.,1999,65:499-505)，进而强化ABE整体代谢网络中的丙酮合成途径。在申请人前期的研究中，申请人发现，在丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养的操作模式下、外添少量乙酸可以在维持甚至提高ABE发酵丁醇浓度的同时，较大幅度地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法，其特征在于调整发酵培养基初始葡萄糖浓度在20‑60g/L；当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期pH触底反弹回升0.2‑0.3后，控制葡萄糖浓度在接近于0‑3.9g/L的低水平，维持ABE厌氧发酵条件直至发酵结束。

【技术特征摘要】
1.一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法，其特征在于调整发酵培
养基初始葡萄糖浓度在20-60g/L；当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期pH触底反弹
回升0.2-0.3后，控制葡萄糖浓度在接近于0-3.9g/L的低水平，维持ABE厌氧发酵条件直
至发酵结束。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于溶剂生产期控制葡萄糖浓度的方法为按需要逐次、
连续添入乙酸和/或活性酿酒酵母培养液。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于调整发酵培养基初始葡萄糖浓度在20-36g/L；当丙
丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期后，控制葡萄糖浓度在0-2.5g/L的低水平，维持ABE
厌氧发酵条件直至发酵结束。
4.权利要求1或3所述的方法，其特征在于调整发酵培养基初始葡萄糖浓度在20g/L；当丙
丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期后，控制葡萄糖浓度在0-1.5g/L的低水平，维持ABE
厌氧发酵条件直至发酵结束。
5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述发酵培养基为玉米粉酶解培养基。
6.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期pH
触底反弹回升0.2-0.3后，通过添加的活性酵母培养液和/或乙酸浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：史仲平，丁健，王浩，罗洪镇，陈锐，何珍妮，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32