利用无血清培养基从成纤维细胞中获得神经细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用无血清培养基从成纤维细胞中获得神经细胞的方法，主要涉及向细胞的基础培养基中添加少量代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物，获得一种新型的无血清培养基，以及使用该新型无血清培养基将不同来源的体细胞直接转分化为神经细胞的方法。利用本发明专利技术制得的无血清培养基可以在不借助外源性转录因子高表达的条件下，将不同来源的体细胞直接转分化为神经细胞。为今后神经细胞在临床疾病治疗中应用提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及神经细胞转分化
，具体地，本专利技术主要涉及向细胞的基础培养基中添加少量代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物，获得一种新型无血清培养基，以及使用该新型无血清培养基直接转分化获得神经细胞的方法。
技术介绍
近几十年以来，得益于小分子药物的大力发展和广泛应用，过去一些严重危害人类健康的疾病能够得到很好的治疗，人均寿命和身体素质都有了很大的飞跃。目前，危害人类健康的疾病的结构已经产生了变化：伴随着衰老而来的一些慢性退行性疾病如帕金森综合症、阿尔茨海默病，糖尿病等逐渐成为危害现代人健康的疑难病症。由于神经细胞的再生能力很差，神经退行性疾病(NeurodegenerativeDiseases)如帕金森病、阿尔茨海默病，以及神经系统损伤性疾病如脊髓损伤、脑损伤等已经成为危害人类健康的重要疾病类型之一。以阿尔兹海默病(Alzheimer’sDisease,AD)为例：在欧美国家，每年因阿尔兹海默病死亡的人数约10万，列于冠心病、癌症和中风后，是第四大致死原因。在中国，对阿尔兹海默病的流行病学调查尚不完善，一般认为65岁以上人群中患病率约为4％，发病率为0.6～1.2％。随着老龄化社会进程的加剧，预计到2050年我国阿尔兹海默病的患者将超过3000万，预期医疗费用超过1万亿。针对阿尔兹海默病的发病机制研究者提出过多种理论，并研制出包括AChE抑制剂、胆碱前体等在内的多种药物。不幸的是，虽然这些药物可以改善患者胆碱能神经的功能障碍，但是并不能根治疾病。其他神经退行性疾病的治疗中也有类似的困境。因此，在继续研究这些神经退行性疾病的发病机理并开发新型小分子药物的同时，也需要从其他新的角度(如以干细胞为基础的再生医学)为神经退行性疾病的治疗开辟新的治疗途径。由于神经退行性疾病一般伴随着大脑特定区域的迟发性神经细胞退行性病变、细胞丢失等特征，因此可以通过移植神经细胞来缓解症状或者治疗疾病。但是，由于神经细胞的细胞结构相对复杂且亚型众多，难以直接从体内分离神经细胞。即使成功分离出神经细胞，也一般不具备扩增能力，因此很难获得足够数量的神经细胞来开展移植实验和治疗。由于神经干细胞具有一定的自我增殖能力，并能够分化为神经系统中主要类型的细胞，因此在神经退行性疾病的治疗中可以发挥更有效的作用。目前，体内来源的神经干细胞在帕金森病，脊髓损伤等疾病模型的治疗中都取得了不错的效果。美国的StemCells公司在瑞典获得批准使用胎脑来源的神经干细胞进行脊髓损伤的I/II期临床使用。NeuroGeneration公司获得美国FDA批准利用病人自身的神经干细胞在体外进行培养后进行I/II期临床实验。然而，目前国际上用于临床前研究的神经干细胞多是从流产胎儿的脑或脊髓中分离，涉及来源不足、伦理争议及免疫排斥等问题，很难大面积推广。因此，依耐体内获得神经细胞的移植治疗在很大程度上受限于细胞来源问题。干细胞领域的发展为人类治疗疾病提供了一条新的途径：从人体内分离出特定的细胞，在体外的一定条件下进行扩增和转换为目的细胞，并在移植回体内后修复或者替换受损的组织和器官，从而达到疾病治疗的目的(Li等，Howfarareinducedpluripotentstemcellsfromtheclinic？Ageingresearchreviews(2010)9(3):257-64；Grabel,Prospectsforpluripotentstemcelltherapies:intotheclinicandbacktothebench.JCellBiochem(2012)113(2):381-7)。研究者曾经计划使用胚胎干细胞(ESCs)体外分化获得神经干细胞或者神经细胞，但是由于胚胎干细胞来源不足、面临伦理争议、免疫排斥以及成瘤风险，这一计划离实际应用有一段很大的距离。2006年诱导多能干细胞技术(iPS技术)的建立，使来源不足、伦理争议以及免疫排斥等问题都在很大程度上都得到了解决(Takahashi等，Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell(2006)126(4):663-76)。而2010年神经转分化技术的建立则可以有效规避成瘤性风险(Vierbuchen等，Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature(2010)463(7284):1035-41)。这样，以干细胞为基础的再生医学有望成为治疗部分疾病尤其是神经退行性疾病的重要手段。综上所述，体外获得神经细胞或者神经干细胞有两种途径：1)利用iPS技术将体细胞变为多能干细胞，再通过定向分化获得神经细胞或者神经干细胞；2)直接利用转分化技术从体细胞出发获得神经细胞或者神经干细胞。早在1973年，Eguchi和Okada就提出了转分化(transdifferentiation)的概念，其是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象。此后，不同的细胞类型转换被科学家发现或者实现：胚胎成纤维细胞转换成具有收缩特性的肌细胞，在成年蝾螈四肢再生过程中，皮肤、肌肉和软骨细胞先转换为祖细胞，B淋巴细胞转换为巨噬细胞，耳蜗细胞转换成功能性的听觉细胞(Izumikawa等AuditoryhaircellreplacementandhearingimprovementbyAtoh1genetherapyindeafmammals.Journal(2005)11(Issue):271-6.)。2008年，Zhou等以Ngn3，Pdx1和Mafa三个因子为主的诱导体系可将20％的胰岛外分泌细胞转化为类似于β-胰岛细胞的细胞。在神经转分化方面，国内外也已经取得了一定的研究进展：2010年，美国科学家成功将小鼠成纤维细胞诱导成为神经细胞(Vierbuchen等，Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature(2010)463(7284):1035-41)。随后，将不同体细胞诱导成为神经细胞以及神经干细胞的技术也逐渐建立了起来(Sheng等，DirectreprogrammingofSertolicellsintomultipotentneuralstemcellsbydefinedfactors.CellRes(2011)22(1):208-18；Wang等，Generationofintegration-freeneuralprogenitorcellsfromcellsinhumanurine.Natmethods(2012)10(1):84-89)。虽然通过转分化获得神经元/神经干细胞的方法相比于采用ES/iPS细胞体外分化来说能够一定程度上规避成瘤风险，且在获得目标细胞的周期上会更短，但是，目前大部分的转分化方法也同样需要借助于在细胞内过表达某几个转录因子而实现，这需要借助于病毒载体等来实现，因此引入了安全性问题，离实际临本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的无血清培养基，其特征在于：该无血清培养基包括基础培养基、代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物；所述代血清添加剂包括胰岛素和转铁蛋白，所述酪氨酸激酶类生长因子包括bFGF，所述小分子化合物包括2‑巯基乙醇和/或亚硒酸钠。

【技术特征摘要】
1.用于将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的无血清培养基，其特征在于：该无血清培养基包括基础培养基、代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物；所述代血清添加剂包括胰岛素和转铁蛋白，所述酪氨酸激酶类生长因子包括bFGF，所述小分子化合物包括2-巯基乙醇和/或亚硒酸钠。2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：其中所述基础培养基为DMEM、MEM、BME、F-10、F-12、RPMI1640、GMEM、αMEM、IMDM中的一种或两种以上的混合物。3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM和F12的混合物，更优选地，所述基础培养基为DMEM和F12体积比为1：1的混合物。4.根据权利要求1或3所述的无血清培养基，其特征在于：所述代血清添加剂为胰岛素和转铁蛋白的混合物；优选地，在最终培养基中胰岛素的浓度在5-10mg/L之间，转铁蛋白的浓度在5.5-100mg/L之间；更优选的，在最终的培养基中胰岛素的浓度为10mg/L，转铁蛋白的浓度为5.5mg/L。5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：所述酪氨酸激酶类生长因子为bFGF；优选地，在最终培养基中bFGF的浓度在0-40ng/ml之间，但浓度不为0；更优选地，在最终培养基中bFGF的浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑辉，何松蔚，陈金龙，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44