灵芝液体菌种的制作、检测方法技术

本发明专利技术涉及一种灵芝液体菌种的制作及检测方法，该方法首先在母种纯化培养基中对灵芝母种进行纯化，纯化后的母种接到摇瓶中在液体培养基中进行培养，培养出的液体菌种取出接种到发酵罐中继续培养，得到的液体菌种经检测合格后即可使用。本发明专利技术所述的母种纯化培养基、液体培养基、发酵罐培养基均有多种配方，可依据情况灵活选择，采用本发明专利技术方法制备的液体菌种具有菌龄一致、渗透性强、生产周期短、萌发早、吃料快的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食用菌栽培
，具体涉及一种灵芝液体菌种的制作、检测方法。
技术介绍
灵芝(Ganodermalucidum)俗称灵芝草，是多孔菌科真菌灵芝的子实体。灵芝具有补气安神、止咳平喘的功效，用于眩晕不眠、心悸气短、神经衰弱、虚劳咳喘等症，对人体有保健作用，对疾病具有预防、治疗或抑制作用。灵芝属高温性菌类，主要生长在较湿润的地方，它的整个生长发育过程中都需要新鲜的空气和湿度较大的生长环境。目前灵芝已经实现了人工大棚化种植，传统的野外采集或人工栽培生产的子实体(或菌核)受到野生资源稀缺、子实体栽培生产周期长(4～5月)、生产受气候等条件控制和生物活性物质含量低等诸多因素制约，对灵芝的大量生产造成了阻碍，也限制了灵芝的产业化。液体制种相对于传统的固体制种更有优势：液体制种利用生物发酵原理，为菌丝生长提供最佳的营养、酸碱度、温度、氧气含量、洁净条件，使菌丝快速生长迅速繁殖，在较短的时间内完成一个发酵周期。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有灵芝栽培中存在的上述问题，提供一种灵芝液体菌种的制作及检测方法，该方法生产的液体菌种具有菌龄一致、渗透性强、生长周期短、萌发早、吃料快等诸多优势，具有大规模推广应用的前景。本专利技术的技术方案如下。一种灵芝液体菌种的制作及检测方法，包括如下步骤：a用体积分数为75%的医用酒精消毒试管，将配制好的母种纯化培养基装入试管后再次灭菌，在酒精灯火焰上方切取0.3cm2菌丝放入试管中并塞好试管口，在适宜条件下培养得纯化灵芝母种；b配制液体培养基并消毒灭菌，接种纯化后的灵芝母种，在摇床上进行培养；c对发酵罐及过滤系统进行消毒；d配制发酵罐培养基并消毒灭菌；e将步骤b制作的灵芝液体菌种接种到发酵罐培养基中进行培养。上述方案中，步骤a中每1L母种纯化培养基配方包括小麦或豆芽50g、土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、琼脂18-20g、KH2PO41.5g以及MgSO40.75g，配制时首先将小麦煮开或土豆煮酥，将豆芽和琼脂剪碎，与其他配料混合后加入蒸馏水定容，常规灭菌40min。上述方案中，步骤b中每1L液体培养基配方包括土豆200g、玉米粉50g、葡萄糖30g、蛋白胨2g、KH2PO41g、MgSO40.5g，或者土豆200g、黄豆5g、葡萄糖30g、KH2PO41.5g、MgSO40.5g，或者土豆200g、脱脂豆奶8g、葡萄糖30g、KH2PO41g、MgSO40.5g。上述方案中，步骤b具体包括以下步骤：将配制好的液体培养基分装入摇瓶，将摇瓶放入灭菌锅，在121℃蒸汽下保温40min，接着自然冷却至室温，在灭菌后的接种箱内将纯化后的灵芝母种接种到摇瓶中，接种后的摇瓶静置培养4天后放在23-25℃的摇床上搅拌培养。上述方案中，步骤c消毒具体为：关闭发酵罐底部阀门，向发酵罐内加水至总容积的70%，关闭发酵罐进气阀门，打开电源开关，将温度设定到121-125℃，达到设定温度后，关闭空气总阀门，打开发酵罐蒸汽阀门，让蒸汽进入过滤器，将过滤器底部的排气阀门打开，排出部分蒸汽，对过滤系统进行灭菌。上述方案中，步骤d中发酵罐培养基包括以下按重量分数计的原料：0.5%的淀粉、0.8%的黄豆、1%的葡萄糖、2%蔗糖、0.15%的KH2PO4以及0.05%的MgSO4或者0.5%的葡萄糖、2%的蔗糖、0.1%的酵母膏、0.1%的蛋白胨、0.15%的KH2PO4以及0.05%的MgSO4，余量均为蒸馏水。上述方案中，步骤e灵芝液体菌种在26-28℃、0.03-0.04MPa条件下进行培养。一种灵芝液体菌种的检测方法，具体为将发酵罐中培养好的灵芝菌种分别接种到3块固体培养基表面，在20-25℃下培养，以10h后3个培养基表面均发白，24h后菌丝开始吃料，48h后吃料深度大于0.2cm，72h后无杂菌污染为使用的标准。所述固体培养基配方按照质量分数计为：玉米棒芯40%，麦麸30%，木屑20%，棉籽壳8.5%，葡萄糖1.5%。本专利技术方法具有以下有益效果：（1）采用本专利技术方法培养的灵芝液体菌种菌龄较为一致，菌丝渗透性强、生长有活力；（2）采用本专利技术方法可大幅度缩短灵芝液体菌种的生产周期至5-7天，而采用现有的固体栽培菌种技术需要30天左右；（3）本专利技术生产的灵芝菌种萌发早、吃料快，比固体菌种提前10~20d成熟；（4）液体菌种有流动性，各个菌丝球和菌丝片断可以流散在不同的部位萌芽，发育点多，内外上下一起长，6~12h菌丝萌发，15~20d可长满栽培袋；（5）液体菌种产量高、原料便宜，综合测算液体菌种的成本不到固体菌种成本的1/3，省去了装瓶、挑弃污染瓶、接种、挖瓶等繁杂劳动，节省了大量劳力、能耗和空间。具体实施方式为使本领域技术人员充分理解本专利技术技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行充分说明。本专利技术培养基的原料均通过常规途径从市场采购，所使用的试管、接种箱、摇瓶、摇床以及发酵罐等均为普通市售。第一步：灵芝母种纯化。母种纯化培养基的配方有如下两种：配方A：1L母种纯化培养基配方包括小麦50g、土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、琼脂18-20g、KH2PO41.5g以及MgSO40.75g。配方B：1L母种纯化培养基配方包括豆芽50g、土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、琼脂18-20g、KH2PO41.5g以及MgSO40.75g。配制时首先将小麦煮开土豆煮酥，豆芽和琼脂剪碎，与其他配料一起加入蒸馏水中定容，常规灭菌40min。将灵芝母种和试管放入接种箱中灭菌20min。用体积分数为75%的医用酒精擦洗消毒试管，将配制好的母种纯化培养基装入试管后再次灭菌，在酒精灯火焰上方切取0.3cm2菌丝放入试管中并塞好试管口，在适宜条件下培养得纯化灵芝母种。第二步：纯化后的灵芝母种摇瓶培养。摇瓶时的液体培养基有三种不同的配方，按照1L液体培养计算其组分如下：配方C：土豆200g、玉米粉50g、葡萄糖30g、蛋白胨2g、KH2PO41g、MgSO40.5g。配方D：土豆200g、黄豆5g、葡萄糖30g、KH2PO41.5g、MgSO40.5g。配方E：土豆200g、脱脂豆奶8g、葡萄糖30g、KH2PO41g、MgSO40.5g。液体培养基的制作方法类似于母种纯化培养基制作方法。将配制好的液体培养基分装入摇瓶中，放到灭菌锅中封好锅口打开放气阀，待大量蒸汽排出时关闭放气阀，锅内温度升至121℃后保温40min，之后使其自然冷却至室温，利用预热将棉塞烘干。将摇瓶和纯化后的母种一起放入接种箱，灭菌后去掉防潮纸扭松棉塞，在酒精灯火焰上方进行接种操作。挑取0.3cm2的菌块迅速将菌丝接入摇瓶中，立刻盖上棉塞，使菌丝均匀分布在培养基表面。接着将摇瓶放在适宜温度下静养4天左右，逆光观察不到任何杂菌时将摇瓶置于23-25℃摇床上搅拌培养。第三步：发酵罐及过滤系统消毒。关闭发酵罐底部阀门，向发酵罐内加水至总容积的70%，关闭发酵罐进气阀门，打开电源开关，将温度设定到121℃--125℃，达到设定温度后，关闭空气总阀门，打开发酵罐蒸汽阀门，让蒸汽进入过滤器，将过滤器底部的排气阀门打开，排出部分蒸汽，对过滤系统进行灭菌。第四步：发酵罐培养。发酵罐培养基的配方也有两种，配方F：0.5%的淀粉、0.8%的黄豆、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灵芝液体菌种的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：a用体积分数为75%的医用酒精消毒试管，将配制好的母种纯化培养基装入试管后再次灭菌，在酒精灯火焰上方切取0.3cm2的菌丝放入试管中并塞好试管口，在适宜条件下培养得纯化灵芝母种；b配制液体培养基并消毒灭菌，接种纯化后的灵芝母种，在摇床上进行培养；c对发酵罐及过滤系统进行消毒；d配制发酵罐培养基并消毒灭菌；e将步骤b制作的灵芝液体菌种接种到发酵罐培养基中进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种灵芝液体菌种的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：a用体积分数为75%的医用酒精消毒试管，将配制好的母种纯化培养基装入试管后再次灭菌，在酒精灯火焰上方切取0.3cm2的菌丝放入试管中并塞好试管口，在适宜条件下培养得纯化灵芝母种；b配制液体培养基并消毒灭菌，接种纯化后的灵芝母种，在摇床上进行培养；c对发酵罐及过滤系统进行消毒；d配制发酵罐培养基并消毒灭菌；e将步骤b制作的灵芝液体菌种接种到发酵罐培养基中进行培养。2.如权利要求1所述的灵芝液体菌种的制作方法，其特征在于：步骤a中每1L母种纯化培养基配方包括小麦或豆芽50g、土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、琼脂18-20g、KH2PO41.5g以及MgSO40.75g，配制时首先将小麦煮开或土豆煮酥，将豆芽和琼脂剪碎，与其他配料混合后加入蒸馏水定容，常规灭菌40min。3.如权利要求1所述的灵芝液体菌种的制作方法，其特征在于：步骤b中每1L液体培养基配方包括土豆200g、玉米粉50g、葡萄糖30g、蛋白胨2g、KH2PO41g、MgSO40.5g，或者土豆200g、黄豆5g、葡萄糖30g、KH2PO41.5g、MgSO40.5g，或者土豆200g、脱脂豆奶8g、葡萄糖30g、KH2PO41g、MgSO40.5g。4.如权利要求1所述的灵芝液体菌种的制作方法，其特征在于，步骤b具体包括以下步骤：将配制好的液体培养基分装入摇瓶，将摇瓶放入灭菌锅，在121℃蒸汽下保温40min，接着自然冷却至室温，在灭菌后的接种箱内将纯化的灵芝...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪琪玮，肖建霞，闵君萍，余敬红，刘国斌，
申请(专利权)人：孝感市应用技术研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42