一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基对氧硫磷水解酶的方法技术

本发明专利技术提出了一利用黄素荧光蛋白锚定并优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法。其步骤为：1)构建融合基因(H6MPH‑EcFbFP)；2)构建重组质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP，同时将通过PCR将带电荷多肽6×Glu的编码序列引入融合蛋白(H6MPH‑EcFbFP)编码基因的3’端，并构建重组质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP(E6)；3)重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，获得基因工程菌株；4)将重组菌株摇瓶培养，并分别提取细胞各组份，检测表面展示效率；5)测量甲基对氧硫磷水解酶的酶活；6)对MPH表面展示的稳定性进行测量。本发明专利技术首次以黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白，将MPH在大肠杆菌中表面展示，展示效率高，制备的MPH酶活稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是甲基对氧硫磷水解酶(MPH)的表面技术，特别是利用黄素荧光蛋白(EcFbFP)这一全新的锚定蛋白，通过优化其所带的电荷以提高甲基对氧硫磷水解酶(MPH)展示效率的方法，是甲基对氧硫磷水解酶(MPH)在大肠杆菌表面展示的一种新思想、新途径、新方法。
技术介绍
在全世界范围内，每年大约要消耗约40万吨的农药用于农业防治，有机磷农药占到总农药使用量的70％，然而有效的利用率不到的1％。随着有机磷农药长期和大范围的使用，越来越多的环境问题、人类健康问题、可持续发展问题日益凸显出来。因此，寻找一种安全、经济、有效的生物降解有机磷农药的方法迫在眉睫。通过微生物酶系降解有机磷农药的方法，基于其成本低和活性高而倍受到人们的重视。异源蛋白质的表面展示系统及其锚定策略方面的研究的快速发展，为高活性、低成本的有机磷水解酶的生产提供了一种新对策，并解决了传统的重组工程菌株产生的降解酶不能自由穿越细胞膜结构，从而导致其在应用时，酶的活性不能够得到充分发挥，以及从工程菌中分离纯化降解酶，由于工艺繁琐和成本高而限制了其推广应用等诸多问题。甲基对硫磷水解酶(MPH)是有机磷水解酶家族中的成员之一，来源于假单胞菌(Pseudomonassp.)，它主要降解甲基对硫磷，还可以降解乙基对硫磷，它们都存在于杀螟松和毒死蜱等有机磷农药中。目前，国内外研究甲基对硫磷水解酶(MPH)的细胞表面展示技术获得了一系列成果，成功构建大肠杆菌MPH展示工程菌。例如，Yang等[3]将Tat信号通路的信号肽TorA，融合到MPH的氨基端，实现其在细胞周质中表达，并测得细胞周质中的酶活是胞质表达的3倍；Yang等[2]将锚定蛋白Lpp-OmpA；AIDA等分别与MPH的氨基端进行融合，实现了MPH在大肠杆菌细胞表面展示，其中Lpp-OmpA作为锚定蛋白展示的MPH的酶活达到1.52U/OD600。但是目前利用大肠杆菌表面展示系统展示MPH还存在一些缺陷，如：(1)固定部位经常发生错误，造成MPH表达不稳定；(2)表达出来的MPH活性不高且活性保持时间不够长；(3)MPH对大肠杆菌有毒性，使细胞在表达过程中发生生长停滞和自溶现象。这些都直接影响MPH的表达和降解有机磷农药的效率。参考文献[1]ShhimazuM,MulchandaniA,ChenW.Cellsurfacedisplayoforganophosphorushydrolaseusingicenucleationprotein[J].BiotechnolProg,2001；17(1):76-80.[2]YangJJ,LiuRH,JiangH,YangY,QiaoCL.Selectionofawhole-cellbiocatalystformethylparathionbiodegradation[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2012；95:1625-1632.[3]YangC,FreudlR,QiaoCL.Exportofmethylparathionhydrolasetotheperiplasmbythetwin-argininetranslocationpathwayinEscherichiacoli[J].JArgricFoodChem,2009,57:8901-8905.
技术实现思路
本专利技术的目的是提出了一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基对氧硫磷水解酶的方法，提高甲基对氧硫磷水解酶(MPH)在大肠杆菌中表面展示效率，提高制备的甲基对氧硫磷水解酶(MPH)的稳定性。本专利技术是这样实现的。用黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白，构建融合蛋白(H6MPH-EcFbFP)，并通过优化黄素荧光蛋白(EcFbFP)所带的电荷，来提高融合蛋白(H6MPH-EcFbFP)在大肠杆菌细胞表面的展示效率；1)重组质粒构建。首先，设计构建融合基因(H6MPH-EcFbFP)；其次，将融合基因(H6MPH-EcFbFP)克隆到表达载体pET23a-T(由本实验室构建或者外购)，构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP；然后，设计PCR引物携带编码带负电荷多肽6×Glu的基因序列，通过PCR引入重组质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP，重新构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP(E6)(结构示意图见图1和图2，氨基酸序列见表1，PCR引物见表2)；表1信号肽和带电荷多肽及其氨基酸序列表2引物名称及引物序列引物方向为5’-3’2)重组菌株构建。将构建好的两种重组质粒转化大肠杆菌表达菌株RosettaBlue感受态细胞，并涂布于LA平板上(氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL)，37℃静置培养过夜，获得重组菌株；3)重组菌株培养和表达。将基因工程菌株，接种于100mLLB培养基，氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL，37℃在200RPM的摇瓶上震荡培养，OD值为0.5～0.6之间，加入IPTG，终浓度为1mM，37℃诱导培养8小时。然后，12000RPM，4℃，10分钟离心收集菌体，菌体用预冷磷酸缓冲液清洗3次，重悬于10mL的预冷磷酸缓冲液中备用；4)细胞各组份的提取。取1mL菌液，12000RPM，4℃，离心2分钟收集菌体，将菌体重悬于1mL预冷的TES缓冲液中，静置5分钟，12000RPM，离心10分钟，离心后的上清即为细胞外膜组份；将沉淀重悬于预冷的MgCl2缓冲液中，4℃静置30分钟，12000RPM，离心10分钟，离心后的上清即为细胞周质组份；将沉淀重悬于预冷的PBS缓冲液之中，即为胞质组份。5)分别取200μL步骤4中的上述各细胞组份，用SDS-PAGE检测。经考马斯亮蓝染色之后，采用灰度扫描的方法来计算各组份中的目的蛋白占总目的蛋白的比例，以此来计算融合蛋白的展示效率；6)菌株的全细胞MPH活性测定。按照文献[1]的方法对菌株的全细胞MPH进行活性测定。收集经IPTG诱导后的细胞培养物，用pH至为8.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于含50μMCoCl2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，并调整其OD600为1.0。酶活反应体系(1000μL溶液)中包含：OD600为1.0的菌悬液200μL，37℃反应2分钟，测定410nm处的吸收值的变化。1个MPH酶活单位(U)定义为每分钟水解1μM对氧磷所需的酶量；7)展示的稳定性检测，参照步骤6中的方法，每天在相同的时间内对同一份样品进行酶活测定，连续测量31天，并绘制酶活的变化趋势。本专利技术是在大肠杆菌细胞表面展示甲基对氧硫磷水解酶，包括黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白，甲基对氧硫磷水解酶(MPH)作为展示的目的蛋白的展示方法，以及在此基础上优化的黄素荧光蛋白(EcFbFP)展示甲基对氧硫磷水解酶(MPH)的展示方法。本专利技术具有的优势。首先，本专利技术建立了一种全新的以黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白的大肠杆菌细胞表面展示系统；其次，利用该展示系统，甲基对氧硫磷水解酶(MPH)实现了在大肠杆菌细胞表面展示，通过优化黄素荧光蛋白所带的电荷，将甲基对氧硫磷水解酶在大肠杆菌表面的展示效率提高了近5倍，展示酶活提高了近10倍；与杨等[2]报道的使用(LPP-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一利用黄素荧光蛋白锚定并优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法，其特征在于步骤为：1)重组质粒构建。首先，设计构建融合基因H6MPH‑EcFbFP；其次，将融合基因(H6MPH‑EcFbFP)克隆到表达载体pET23a‑T，构建重组表达质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP；然后，设计PCR引物携带编码负电荷多肽6×Glu的基因序列，通过PCR引入重组质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP，重新构建重组表达质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP(E6)；2)重组菌株构建。将构建好的两种重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，并涂布于LA平板，37℃静置培养16h，获得重组菌株；3)重组菌株培养和表达。接种重组菌株于氨苄青霉素浓度100μg/mL的LB培养基中诱导培养，培养条件为：首先，37℃200RPM震荡培养，在OD值为0.5～0.6之间，加入IPTG，终浓度为1mM，37℃继续诱导培养8小时；然后，12000RPM，4℃，10分钟离心收集菌体，菌体用预冷PBS清洗3次，重悬于10mL的预PBS中备用；4)细胞组份提取。取1mL菌液，12000RPM，4℃，离心2分钟收集菌体，将菌体重悬于1mL预冷的TES缓冲液中，静置5分钟，12000RPM，离心10分钟，离心后的上清定义为细胞外膜组份；将沉淀重悬于1mL预冷的MgCl2缓冲液中，4℃静置30分钟，12000RPM，离心10分钟，离心后的上清定义为细胞周质组份；将沉淀重悬于1mL预冷的PBS缓冲液之中，定义为细胞胞质组份；5)细胞表面展示效率测定。分别取200μL步骤4中的上述各细胞组份，用SDS‑PAGE检测。经考马斯亮蓝染色之后，采用灰度扫描的方法来计算各组份中的目的蛋白占总目的蛋白的比例，以此来计算出MPH的展示效率；6)细胞表面展示MPH活性测定。按照文献[1]方法对细胞表面展示MPH进行活性测定。7)展示MPH稳定性测定。参照步骤6中的方法，每天在相同的时间内对同一份样品进行酶活测定，连续测量31天，并绘制酶活的变化趋势。...

【技术特征摘要】
1.一利用黄素荧光蛋白锚定并优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法，其特征在于步骤为：1)重组质粒构建。首先，设计构建融合基因H6MPH-EcFbFP；其次，将融合基因(H6MPH-EcFbFP)克隆到表达载体pET23a-T，构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP；然后，设计PCR引物携带编码负电荷多肽6×Glu的基因序列，通过PCR引入重组质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP，重新构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP(E6)；2)重组菌株构建。将构建好的两种重组质粒转化大肠杆菌表达菌株RosettaBlue感受态细胞，并涂布于LA平板，37℃静置培养16h，获得重组菌株；3)重组菌株培养和表达。接种重组菌株于氨苄青霉素浓度100μg/mL的LB培养基中诱导培养，培养条件为：首先，37℃200RPM震荡培养，在OD值为0.5～0.6之间，加入IPTG，终浓度为1mM，37℃继续诱导培养8小时；然后，12000RPM，4℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贞，马立新，卞璐，唐荣兴，沈威，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42