本发明专利技术公开了一种快速套氏PCR用于检测羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒及检测方法。选用羊新疆巴贝斯虫红细胞入侵相关蛋白(rap‑1)作为靶基因，根据rap‑1基因序列，设计合成双向套氏特异性引物4个，组合成种特异性引物，XJ‑fullF(5'‑CGGTAGTGTGTTGATATCCTAGAG‑3')，XJ‑fullR(5'‑CACAAGCGTTACATCGTAGAGCCG‑3')，和XJ‑internalF(5'‑AATGACCGCCCGCGAAATCAGCCACGA C‑3')，XJ‑internalR(5'‑GTGGGTGGCGAAGGACAATTTGTTG‑3')，建立田间血液样品羊新疆巴贝斯虫的套氏PCR检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒及检测方法，具体而言，是涉及一种使用Nested-PCR检测羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒及检测方法。
技术介绍
羊巴贝斯虫病是由羊巴贝斯虫(Babesiaspp.)引起绵羊和山羊的一种蜱传性血液原虫病，寄生于绵羊或山羊红细胞内[1]。已报道的感染羊的巴贝斯虫种有绵羊巴贝斯虫(Babesiaovis)，莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和粗糙巴贝斯虫(B.crassa)，该病是主要分布在热带和亚热带地区的血液原虫病。临床反应通常以高热，溶血性贫血，黄疸，血红蛋白尿为主要特征，严重时引起死亡。本病危害严重，严重时可引起死亡，给养羊业造成重大经济损失。在中国鉴定了感染绵羊和山羊的若干个巴贝斯虫分离株，根据18SrRNA和ITS序列分析，分为两个系统进化组：莫氏巴贝斯虫和新疆巴贝斯虫未定种。羊新疆巴贝斯虫未定种是最近发现的新种，该虫体的传播媒介均为小亚璃眼蜱。为我国特有病原。目前该虫种已在中国广泛分布流行，直接威胁着我国养羊业的发展。所以，制定有效的检测预报系统对该病的防治十分迫切和必要。对巴贝斯虫的诊断，传统的方法建立在血涂片的形态学检查和临床症状，这些方法对于检测急性病例是很可靠的，但是对于慢性的病例具有局限性。一些血清学检测方法也常用于巴贝斯虫的诊断，如IFAT和ELISA，但这些方法通常对相近的虫种产生交叉反应。与这些方法相反的，以PCR为基础的分子诊断方法具有，直接、特异性、敏感性较好等特点。目前在我国，常用的分子诊断方法，如LAMP、RLB等已用于鉴定羊巴贝斯虫的感染。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于检测羊新疆巴贝斯虫的DNA的检测试剂盒及检测方法。本专利技术用于检测羊新疆巴贝斯虫的DNA，基于rap-1为靶基因，该基因属于多基因家族，在新疆巴贝斯虫基因组上，已发现7个基因拷贝，本专利技术的引物设计在7个拷贝的保守区，确保了7个拷贝都可被PCR扩增获得，从而大大提高了检测限。本专利技术用于检测羊新疆巴贝斯虫的DNA的检测试剂盒及检测方法的制备方法是在新疆巴贝斯虫的rap-1基因的保守区分别人工设计合成双向套氏特异性引物4个，进行套氏PCR扩增，根据目的片段的大小，通过核酸电泳检测结果。本专利技术的检测试剂盒检测羊新疆巴贝斯虫的方法是以待检测羊血提取的DNA为模板，在羊新疆巴贝斯虫rap-1基因序列的保守区域设计一对扩增出的片段大小为1400bp的引物，获得的PCR产物，100倍稀释后，再利用在rap-1基因保守区设计的内部引物再进行PCR扩增，获得片段大小为506bp的PCR产物，将第二轮获得的PCR产物经核酸电泳进行结果检测。具体而言，根据本专利技术提供了1.一种检测羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒，其特征在于，含有两组Nested-PCT引物，第1组引物XJ-fullF:5'-CGGTAGTGTGTTGATATCCTAGAG-3'(SEQIDNO.1),XJ-fullR:5'-CACAAGCGTTACATCGTAGAGCCG-3'(SEQIDNO.2)；以及第2组引物XJ-internalF:5'-AATGACCGCCCGCGAAATCAGCCACGAC-3'(SEQIDNO.3)，XJ-internalR:5'-GTGGGTGGCGAAGGACAATTTGTTG-3'，(SEQIDNO.4)2.如上述1所述的诊断试剂盒，还包括：红细胞裂解液、细胞裂解液、蛋白沉淀液、异丙醇、乙醇。3.如上述1或2所述的诊断试剂盒，还包括：限制性内切酶HindIII和NotI。4.一种检测羊新疆巴贝斯虫未定种的方法，包括如下步骤(1)取待测羊血，制备待测DNA；(2)以(1)制备的待测DNA为模板，利用引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，进行第一轮PCR扩增；(3)取(2)中得到的PCR产物1ul，并与99ul去离子水混匀，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增引物对为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；(4)取第二轮PCR扩增产物5ul，上胶电泳，并观察电泳结果。5.如上述4所述的方法，其中步骤(1)中取待测羊血后，分别加入红细胞裂解液、细胞裂解液、蛋白沉淀液、异丙醇、乙醇等处理后，得到待测DNA样品，在待测DNA样品中，加入限制性内切酶进行预处理。6.如上述4或5所述的方法，所述限制性内切酶是HindIII和NotI。7.如上述4-6任一项所述的方法，所述限制性内切酶的反应温度为37℃，反应时间为1-1.5小时。8.如权利要求4至7任一项所述的方法，所述第一轮PCR扩增反应的条件为9.如权利要求4至8任一项所述的方法，所述第二轮PCR扩增反应的条件为本专利技术具有如下效果：采用本专利技术的检测试剂盒可以很方便地检测羊新疆巴贝斯虫的感染，同时由于本专利技术的检测基因为多拷贝的基因，包含有7个拷贝，大大提高了检测限。本专利技术的方法最大优点是可以通过特异，敏感的PCR扩增，快速的检测到动物是否感染有羊新疆巴贝斯虫。这对于疾病的控制及预防有重要的意义。本专利技术的敏感性要高于普通PCR，这一特性在流行病学调查上具有重要意义。尤其是取待测羊血后，分别加入红细胞裂解液、细胞裂解液、蛋白沉淀液、异丙醇、乙醇等处理后，得到待测DNA样品，在待测DNA样品中，加入限制性内切酶HindIII和NotI进行预处理，使用这样的DNA样品作为模板，极大地提高了检测的准确率，减少了干扰。采用本专利技术的检测试剂盒进行检测的方法非常的简单，而且检测用时较少，其检测成本相对也比较低，而且漏检率要远远小于现有技术。附图说明图1：限制性内切酶处理和未处理的待测DNA作为模板的结果。图2：部分田间羊血液样品检测结果图。具体实施方式实施例1特异性引物设计与合成：根据已报道的羊巴贝斯虫rap-1基因序列，经过序列比对，在羊新疆巴贝斯虫的保守区，且可与其他虫种区分的区域设计针对该虫种的特异性引物，并命名为：XJ-fullF，XJ-fullR，XJ-internalF和XJ-internalR，将合成的引物用去离子水溶解至储存浓度100uM，寻找最佳浓度用于PCR扩增。具体的做法如下：引物由专业公司按设计要求合成，在保守区设计好后，将引物的序列发给专业公司，由他们合成，本专利技术是由兰州生工公司合成引物。用去离子水稀释羊新疆巴贝斯虫的特异性引物待用。实施例2检测试剂盒的制备1、羊新疆巴贝斯虫裂殖子的制备选试验除脾羊4只，用液氮保存的含有吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和新疆巴贝斯虫未定种的血液红细胞颈静脉接种，感染除脾羊。在感染羊后，每天肌肉注射地塞米松，首次4支/羊，以后2支/羊，每天射一次，直至染虫率升高为止。从感染之日起，每天早晨测量羊的体温，从体温开始上升之日起，每天从耳缘静脉涂制血片，甲醇固定两次，姬母萨染色后，用显微镜检查红细胞染虫率。当红细胞染虫率达到10.0％以上时，颈动脉放血，20.0％枸橼酸钠抗凝，得到待检测的血样。虫体DNA的分离与提纯，本实施例使用的是QIAampDNABloodKit(QIAGEN,美国)andQIAampDNAMiniKit(QIAGEN,德国)。(1)加300ul血液于盛有900ul红细胞裂解液(RBCCellLysisSolution)的1.5ml的离心管中，室温孵育本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒，其特征在于，含有两组Nested‑PCT引物，第1组引物XJ‑fullF:5'‑CGGTAGTGTGTTGATATCCTAGAG‑3'(SEQ ID NO.1),XJ‑fullR:5'‑CACAAGCGT TACATCGTAGAGCCG‑3'(SEQ ID NO.2)；以及第2组引物XJ‑internalF:5'‑AATGACCGCCCGCGAAATCAGCCACGAC‑3'(SEQ ID NO.3)，XJ‑internalR:5'‑GTGGGTGGCGAAGGACAATTTGTTG‑3'，(SEQ ID NO.4)。
【技术特征摘要】
1.一种检测羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒，其特征在于，含有两组Nested-PCT引物，第1组引物XJ-fullF:5'-CGGTAGTGTGTTGATATCCTAGAG-3'(SEQIDNO.1),XJ-fullR:5'-CACAAGCGTTACATCGTAGAGCCG-3'(SEQIDNO.2)；以及第2组引物XJ-internalF:5'-AATGACCGCCCGCGAAATCAGCCACGAC-3'(SEQIDNO.3)，XJ-internalR:5'-GTGGGTGGCGAAGGACAATTTGTTG-3'，(SEQIDNO.4)。2.如权利要求1所述的诊断试剂盒，还包括：红细胞裂解液、细胞裂解液、蛋白沉淀液、异丙醇、乙醇。3.如权利要求2所述的诊断试剂盒，还包括：限制性内切酶HindIII和NotI。4.一种检测羊新疆巴贝斯虫未定种的方法，包括如下步骤(1)取待测羊血，制备待测DNA；(2...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛庆丽，刘志杰，杨吉飞，潘玉萍，关贵全，罗建勋，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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