猪精液体外低温保存用稀释剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪精液体外低温保存用稀释剂及其制备方法；所述稀释剂包括如下各组分：D‑果糖、2‑氨基‑2‑羟甲基‑1，3‑丙二醇、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、N‑乙酰基‑半胱氨酸、脱脂奶粉、蛋黄冻干粉、硫酸丁胺卡那霉素等广谱抗生素抑菌剂。本发明专利技术用于猪鲜精液体外保存的稀释剂，适合在低温(4℃‑5℃)体外保存猪鲜精液，该稀释剂显著抑制低温保存过程中对精子结构产生的损伤，维持猪精子糖代谢及氧化磷酸化代谢过程，有效延长猪精子低温保存的存活时间，显著提高优质种公猪精液的使用效率及养殖的经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物繁殖
，具体涉及一种猪精液体外低温保存用稀释剂及其制备方法。
技术介绍
瑞典、英国、加拿大及美国等国家，在家畜动物育种及实际繁殖生产中已经建立人工授精技术平台并且形成产业化，经济效益显著。而我国是一个养猪和消费大国，年产生猪量约6亿多头，猪肉产量约为6500万吨，随着人们生活水平的提高，人均猪肉的消费量逐年增加，养猪方式逐渐从传统的庭院饲养方式转变为工厂化、集约化和规模化。我国由于饲养等因素，导致猪品种质量下降，如何有效利用优质种猪资源进行联合育种，提高优质猪种质资源的利用率是目前养殖业亟待解决的问题。随着国家生猪改良政策支持及联合育种的推广，国外高端优质种公猪的引进数量逐渐增加，优质种公猪的高效利用已经引起广泛重视。然而，缺乏可支撑体选育技术系，地方优良品种以及引进优质品种利用不足，导致整个繁育体系运行呈现“引进-扩繁-退化-再引进”依赖型循环状态。优质种猪的利用率低等问题逐渐显现，已经成为目前养猪企业较为关注的突出问题。如何增强种猪的利用效率，提高繁殖生产效率，逐渐适应国内外消费市场对猪肉产品的新要求，扩大养猪企业生存和发展空间，实现上海地区养猪业可持续循环发展是目前亟待解决的问题。家畜动物牛、马冷冻精子已经成功用于繁殖生产中，但猪冻精繁殖缺乏相应技术标准没有达到普及推广，尤其是冻精繁殖受孕及产仔数降低是冻精利用推广的瓶颈，目前全球猪冻精的使用率不足1％。实际猪繁殖生产中，普遍利用17℃保存的新鲜精液进行人工输精。然而，17℃保存的猪鲜精液有效利用期一般为3-5天，这样在一定程度上限制优质公猪鲜精液的有效利用率。因此，生猪繁殖生产中，冻精保存时间长，但繁殖受孕率、产仔数降低。相反，鲜精17℃人工输精繁殖生产效率与自然交配繁殖率相似，但因保存温度高，精子代谢相对超低温冷冻保存时明显增强，能量消耗过快致使精子体外存活时间缩短，因此精液有效利用期只有3-5天，致使优质种公猪精液利用率大大降低。如何在确保受孕率及产仔数的同时，又能延长体外保存时间，最大限度利用优质种公猪资源，是目前养殖业亟待解决的关键问题。猪精液体外保存时温度直接影响精子的代谢以及存活寿命，而与保存温度相适应的稀释防护剂配制是人工授精繁殖涉及到的关键性技术之一。研究表明，体外保存过程中，精子活力、存活时间以及质膜、顶体完整率等质量特性直接影响人工输精的受孕率。猪精子与其它哺乳动物的精子类似，在超低温冷冻保存过程中，精子对低温损伤及氧化损伤的抗性较弱，致使精子活力下降，质膜完整率及顶体完整率亦明显降低，人工授精的受孕率及胎仔数均低于自然繁殖(Watson，AnimReprodSci，2000，42：251～260.)。Petrunkina等(Theriogenology.2005)从理论上对动物精子冷冻保存作了进一步分析，认为在冻融过程中质膜结构发生变化引起精子的损伤，进而导致冻融精子的死亡或产生类似凋亡现象，从而引起母猪受孕率及产子数降低。理论上，4℃低温保存能够有效延长精液保存时间，避免精子的冷冻及解冻损伤，使精液利用率最大化。然而，目前在实际生产中尚未使用4℃温度保存的猪精液。研究证实，4℃低温保存时可能破坏了精子顶体质膜完整性，使细胞骨架发生不同程度迁移，导致细胞无法承受渗透压变化，精子供能途径受阻，细胞内ATP供应不足致使活力下降(Zhao等，AnimalScienceJournal，2013，84：600-606)；其次，精液在体外保存过程中，细胞内会产生过多不稳定的活性氧离子(ROS)，使ROS在精子细胞中沉积，引起细胞发生氧化应激反应，造成精子质膜和顶体受损，导致活力下降(Roland等，Theriogenology，2006，66：1115-1123)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述现有技术中指出的针对低温(4℃-5℃)温度保存猪精液时所产生的不利因素，筛选出有利于维护猪精子结构稳定性、增强精子抗氧化损伤的稀释剂成分，提供一种猪精液体外低温(4℃-5℃)保存用稀释剂及其制备方法。利用该稀释液低温4℃保存猪精液时，显著降低精子ROS氧化损伤，有利于维持猪精子的质膜完整性及顶体完整性，能有效延长猪精子低温保存的存活时间，提高优质种公猪精液使用效率及人工养殖的经济效益。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种猪精液体外低温保存用稀释剂，所述稀释剂包括如下组分：D-果糖、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、N-乙酰基-半胱氨酸、脱脂奶粉、蛋黄冻干粉和广谱抗生素抑菌剂。优选地，按所述稀释剂体积为100mL计，包括：所述稀释剂的pH值为6.80～7.30，渗透压为280～350mOsmo/mL。优选地，所述脱脂奶粉和蛋黄冻干粉的用量比为用量比为1∶0.31～1∶1.86。更优选为1∶0.5～1∶1.4；在该用量范围内，稀释剂中的脱脂奶粉和蛋黄冻干粉能协同发挥最佳的乳化作用以及非渗透性保护作用，进而可以更好地维持猪精子活力各项参数，有效延长猪精子体外存活的时间。优选地，所述脱脂奶粉为超声波加工处理后的脱脂奶粉；所述蛋黄冻干粉为超声波加工处理后的蛋黄冻干粉；超声波的参数范围：频率范围为20～25KHz，超声时间为5～30min。优选地，所述广谱抗生素抑菌剂包括硫酸丁胺卡那霉素、阿莫斯林、庆大霉素、青霉素、头孢类抗生素中的一种或几种。优选地，所述猪精液体外低温保存用稀释剂中低温指的是4℃～5℃。优选地，按所述稀释剂体积为100mL计，包括：优选地，按所述稀释剂体积为100mL计，包括：第二方面，本专利技术还涉及一种前述的猪精液体外低温保存用稀释剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：S1、称取所述D-果糖、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、N-乙酰基-半胱氨酸溶于重蒸水或者超纯水中；S2、依次加入脱脂奶粉、蛋黄冻干粉，超声混合；S3、加入广谱抗生素抑菌剂，最后用重蒸水或者超纯水混合均匀定容至100mL即可。优选地，步骤S2中，所述超声混合是以60～80频率振幅超声5～10分钟。本专利技术采用D-果糖、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠等成分，N-乙酰基-半胱氨酸、脱脂奶粉、蛋黄冻干粉、硫酸丁胺卡那霉素等常规抑菌剂配制成猪精液体外低温保存的稀释剂。该稀释剂能有利于维持猪精子代谢功能，为精子提供充足的ATP用于保存自身一定的活力，有效延长猪精子低温体外保存过程中的存活时间。本专利技术的新型猪精液体外低温(4℃-5℃)保存稀释剂，有提供能量代谢基础的糖类、离子中间载体、渗透压调节剂、抗氧化剂、维持精子质膜结构稳定性的乳化剂以及广谱抗菌剂等多种成分。利用该新型稀释剂体外低温(4℃-5℃)保存猪精液过程中，体现如下特点：能够在低温条件下，为处于似休眠状态的精子提供充分的能量，用以维持正常的代谢活动；能够为处于低温环境中的猪精子提供适宜渗透压、pH内环境，保证精子的正常生理机能；具有良好的抗氧化作用，有效抑制ROS的产生及精子凋亡，增强精子的抗氧化损伤能力；具有较高的乳化作用，有效抑制精子质膜与活性氧离子(ROS)接触而发生的过氧化反应，有效地保护精子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪精液体外低温保存用稀释剂，其特征在于，所述稀释剂包括如下组分：D‑果糖、2‑氨基‑2‑羟甲基‑1，3‑丙二醇、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、N‑乙酰基‑半胱氨酸、脱脂奶粉、蛋黄冻干粉和广谱抗生素抑菌剂。

【技术特征摘要】
1.一种猪精液体外低温保存用稀释剂，其特征在于，所述稀释剂包括如下组分：D-果糖、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、N-乙酰基-半胱氨酸、脱脂奶粉、蛋黄冻干粉和广谱抗生素抑菌剂。2.如权利要求1所述的猪精液体外低温保存用稀释剂，其特征在于，按所述稀释剂体积为100mL计，包括：所述稀释剂的pH值为6.80～7.30，渗透压为280～350mOsmo/mL。3.如权利要求1或2所述的猪精液体外低温保存用稀释剂，其特征在于，所述脱脂奶粉和蛋黄冻干粉的用量比为1∶0.31～1∶1.86。4.如权利要求1或2所述的猪精液体外低温保存用稀释剂，其特征在于，所述广谱抗生素抑菌剂包括硫酸丁胺卡那霉素、阿莫斯林、庆大霉素、青霉素、头孢类抗生素中的一种或几种。5.如权利要求1或2所述的猪精液体外低温保存用稀释剂，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新红，付杰丽，李玉华，王立蕊，姜红菊，严国祥，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31