表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒、由其制备的疫苗和应用制造技术

本发明专利技术公开了表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒、由其制备的疫苗和应用。本发明专利技术分别以融合有碱性蛋白酶裂解位点的口蹄疫病毒2A基因、口蹄疫病毒IRES元件为Linker构建得到两组含有EV71病毒衣壳蛋白P1基因和3CD基因的EV71亚基因组；本发明专利技术进一步将所述亚基因组重组至腺病毒表达载体中，经筛选分别获得一株复制能力好、遗传稳定且蛋白表达量高的重组腺病毒，其在感染的细胞中能够高效表达P1和3CD蛋白，同时3CD能够对P1进行正确切割；在小鼠体内能诱导高水平的EV71特异性广谱中和抗体，其诱导抗EV71特异性细胞免疫应答的能力显著优于灭活全病毒抗原，可应用于防治由EV71引起的人手足口病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组腺病毒，尤其涉及表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒，本专利技术还涉及由所述重组腺病毒在制备预防或治疗手足口病的疫苗中的应用，属于重组腺病毒的构建及应用领域。
技术介绍
肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是引起人手足口病(Hand,FootandMouthDisease,HFMD)的主要病原。该病多发于5岁以下儿童，患儿除发生手、足、口腔等部位的疱疹外，临床上还表现为疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹，病症严重者可引起死亡。目前还无有效的措施阻止EV71疾病的流行，在疫情爆发时唯一控制EV71流行的方法就是公共卫生监督和隔离。目前国内外EV71疫苗的研究主要集中在全病毒灭活疫苗。虽然灭活疫苗能够诱导高水平的中和抗体，可是制备灭活疫苗的种毒是活病毒，在生产过程中存在散毒的风险。因此，开发更加安全有效的新型疫苗是未来的发展方向。腺病毒(Adenovirus，Ad)载体在多种哺乳动物细胞上能够高效地进行基因转导和蛋白表达，使其在疫苗开发及基因治疗的研究中广受青睐。最常用的腺病毒载体是缺损腺病毒5型，它是一种复制缺陷性型病毒，因缺失了复制所必须的E1和E3基因，导致其在体内不能复制，这就保证了该病毒作为疫苗载体的安全性，也因此排除了针对载体免疫应答的干扰，保证了载体疫苗在重复使用时的有效性。缺损腺病毒5型载体具有较好的诱导特异性细胞介导免疫应答的能力；使用重组腺病毒疫苗时，不用佐剂即可以达到良好的免疫效果；同时，腺病毒在感染细胞内不发生整合，这就排除了致癌和致突变的危险；Ad4和Ad7活载体疫苗已在美国批准使用30年，缺损型Ad5应用于基因治疗也有30年历史，至今在人类肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒基因的整合。目前，已用腺病毒载体表达了多种病原体(包括细菌、病毒等病原微生物)的基因。动物试验表明，腺病毒载体疫苗由于能够同时诱导坚强的体液免疫和细胞介导免疫应答反应，所以用相应病原体攻击时的免疫保护效果均比较理想。P1是EV71病毒的结构蛋白，在非结构蛋白3CD的作用下可裂解为衣壳蛋白VP0、VP1和VP3，并且能自动组装成病毒空衣壳。空衣壳在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性，但不具有感染性，因此不存在散毒的风险。有研究者尝试开发以腺病毒为载体表达EV71病毒衣壳蛋白的新型疫苗，但是由于构建策略不合理以及获得的重组腺病毒不稳定等因素，致使EV71病毒衣壳蛋白表达量极低而无应用前景(戈小琴等，中国生物制品学杂志，2010)。因此，构建稳定、高效表达EV71病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，对于研制防治人手足口病的新型疫苗具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供两组含有EV71病毒衣壳蛋白P1基因和3CD基因的EV71亚基因组；本专利技术的目的之二是提供两株稳定、高效表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒，该重组腺病毒能稳定、高效的表达EV71病毒的衣壳蛋白且遗传稳定，能够将其应用于制备预防或治疗人手足口病的疫苗。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来现实的：本专利技术分别以碱性蛋白酶裂解位点和口蹄疫病毒2A基因相连接的融合基因、具有高翻译起始效率的口蹄疫病毒IRES元件为Linker，分别构建了两组含有人肠道病毒71型(EV71)病毒结构蛋白前体P1基因和病毒蛋白酶3CD基因的亚基因组，即：P1-F2A-3CD和P1-IRES-3CD，两组亚基因组的核苷酸序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。口蹄疫病毒(FMDV)的2A蛋白和IRES元件常用于构建多个基因共表达的linker。但是，口蹄疫病毒的2A蛋白作为linker时，往往会与其前面的蛋白形成一个融合蛋白，2A的残留可能会影响该蛋白的折叠，进而影响蛋白的活性及空衣壳的组装。本专利技术通过大量的实验发现：在VP1蛋白和2A蛋白之间引入碱性蛋白酶裂解位点(Furincleavagesite)，蛋白翻译后细胞内的碱性蛋白酶可将linker2A蛋白剪切掉，成功解决了2A蛋白残留对EV71VP1蛋白折叠以及空衣壳组装带来的影响。IRES元件的起始蛋白合成效率受其来源以及序列差异的影响较大。不同种属病毒来源的IRES元件，其翻译起始效率差异非常大；即便是同一种属病毒，不同毒株来源的IERS翻译起始效率也不尽相同。另外，即使是同一IRES在不同的表达系统中起始蛋白的合成效率也存在较大的差异，即IRES的使用需要与表达系统相匹配。本专利技术通过大量的筛选实验最终发现，只有选用FMDVO/YS/CHA/05病毒株的IRES作为连接人肠道病毒71型(EV71)病毒结构蛋白前体P1基因和病毒蛋白酶3CD基因的linker，才能在腺病毒表达系统中实现起始3CD基因的高效表达。本专利技术还公开了含有所述亚基因组P1-F2A-3CD或亚基因组P1-IRES-3CD的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞；其中，所述的表达载体优选为腺病毒表达载体。本专利技术将EV71亚基因组P1-F2A-3CD和P1-IRES-3CD插入到腺病毒穿梭载体中并与人缺损型腺病毒5型基因组进行同源重组，经大量的噬斑筛选和鉴定，最终筛选获得了两株能够高效、稳定表达EV71衣壳蛋白的重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B：本专利技术经多轮噬斑筛选获得了4株能够快速、稳定致HEK-293细胞病变的重组腺病毒，分别为Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17。这4株重组腺病毒对HEK-293细胞致细胞病变效应与野生型腺病毒Ad5-WT相似。将上述4株重组腺病毒在HEK-293细胞上连续传10代，细胞均在60h左右完全病变。4株重组腺病毒的增殖滴度略低于野生型腺病毒Ad5-WT，但生长曲线动态相似。本专利技术进一步将重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17在HEK-293细胞上传代，对传至第3和第10代的病毒用特异性引物扩增EV71VP1基因。结果表明，第3代的4株重组腺病毒经PCR扩增VP1基因丰度相似；然而，第10代重组腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17的VP1基因丰度明显低于Ad5-A、Ad5-B。推测Ad5-A13、Ad5-B17在传代过程中目的基因可能发生了丢失，而Ad5-A、Ad5-B具有良好的遗传稳定性。Westernblot结果表明，本专利技术获得的重组腺病毒(Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17)在感染的HEK-293细胞中能够表达EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同时3CD对P1进行了正确切割。另外，第3代和第10代重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B与MAb22A12反应条带的眼观显示密度相似，而第10代重组腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17较其第3代与MAb22A12反应条带的眼观显示密度明显减弱，Westernblot结果与PCR检测结果相一致。上述结果表明，重组腺病毒Ad5-A以及Ad5-B能够稳定、高效表达EV71病毒衣壳蛋白。本专利技术通过大量的噬斑筛选，最终筛选获得复制能力好、遗传稳定而且蛋白表达量高的两株重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B，这也是后期鼠体免疫效果好的重要原因。本专利技术将筛选获得的重组腺病毒Ad5-A提交专利本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码人肠道病毒71型衣壳蛋白的亚基因组P1‑F2A‑3CD，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.编码人肠道病毒71型衣壳蛋白的亚基因组P1-F2A-3CD，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。2.编码人肠道病毒71型衣壳蛋白的亚基因组P1-IRES-3CD，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1所述亚基因组P1-F2A-3CD或权利要求2所述亚基因组P1-IRES-3CD的表达载体；优选的，所述表达载体是腺病毒表达载体。4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5.权利要求1所述亚基因组P1-F2A-3CD在制备预防或治疗人手足口病疫苗或药物中的应用。6.权利要求2所述亚基因组P1-IRES-3CD在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：于力，杨德成，梁争论，毛群颖，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23