本发明专利技术公开了一种TM‑1基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用，从MG S6株中分别扩增出TM‑1基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC315‑MCS‑EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315‑TM‑1‑EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有TM‑1基因的重组腺病毒pBH‑TM‑1‑EGFP；本发明专利技术用于免疫鸡以预防鸡慢性呼吸道病，将此重组腺病毒免疫鸡后，鸡的抗体水平得到显著提高，且对鸡产生有效的免疫保护作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及于基因生物工程领域，尤其是及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用MGTM-1基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用。
技术介绍
鸡慢性呼吸道病(Chronicrespiratorydisease,CRD)是由鸡毒支原体(MycoplasmaGallisepticum,MG)感染引起的接触性、慢性呼吸道传染病。CRD主要引起产蛋鸡产蛋量下降，蛋的品质降低，饲料转化率降低，常给养鸡业带来巨大的经济损失。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可以预防和控制上述两种疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程活载体疫苗同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种TM-1基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用，将MG的膜外蛋白基因(TM-1基因)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达该基因的重组腺病毒，检测免疫鸡后机体内产生的抗体水平，通过免疫攻毒保护试验检测其免疫保护效果，评价研制的预防CRD的基因工程活载体疫苗。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种TM-1基因构建重组腺病毒的方法，包括以下步骤：1)从MGS6株中扩增出TM-1基因序列GI：S65869.1；所述的TM-1基因的扩增包括：以TM-1-FSEQIDNO.1和TM-1-RSEQIDNO.2为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；2)将TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315-TM-1-EGFP；3)将重组穿梭质粒pDC315-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP。所述的TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。所述的TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防鸡慢性呼吸道疾病疫苗中的应用。本专利技术的有益效果是：将MG的免疫保护性基因TM-1基因与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达该基因的重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP，籍此研制预防CRD的基因工程活载体疫苗。通过对免疫鸡的抗体水平检测和免疫攻毒试验，评价了重组腺病毒的免疫效果。研究结果表明，免疫重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP的雏鸡，21日龄后免疫鸡的平均抗体可达到有效抗体水平(OD405＞0.49)，且免疫保护效果与市场弱毒疫苗相当。附图说明图1是TM-1基因PCR扩增结果图(M:DL2502DNA分子质量标准；1:TM-1基因PCR产物；2:pMD-TM-1质粒PCR产物)。图2是pDC315-TM-1-EGFP质粒双酶切结果图(M:DL2502DNA分子质量标准；1:pDC315-TM-1-EGFP经SalI和XmalI的双酶切产物)。图3是重组腺病毒感染HEK293细胞(×100)图(A：正常HEK293细胞图；B：荧光显微镜下正常HEK293细胞图；C：重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP感染HEK293细胞图；D：重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP感染HEK293细胞荧光图)。图4是重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP的TM-1基因的PCR扩增结果图(M:DL2502DNA分子质量标准；1、2:TM-1基因PCR产物)。图5是WesternBlot检测在重组腺病毒感染HEK293细胞后TM-1蛋白的表达情况图。图6是ELISA检测鸡免疫MG疫苗后的抗体水平情况图(从14日龄开始，免疫pBH-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP对照组鸡抗体水平差异极显著；自28日龄开始，免疫pBH-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与MG弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平差异极显著)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：鸡慢性呼吸道病(CRD)是严重威胁养鸡业的鸡的重要的呼吸道传染病。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可以预防和控制该疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足。腺病毒载体相比其他载体具有明显的优势，国内外均有很多以腺病毒为载体制备疫苗的报道，目前腺病毒载体系统已经相当成熟。对MG的研究也已较为清晰，有报道利用其它活载体研制CRD的基因工程疫苗，且免疫攻毒试验证实对鸡有一定的保护作用，因此，本专利技术利用鸡毒支原体TM-1基因构建重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP，籍此研制预防CRD的基因工程活载体疫苗。本专利技术鸡MGTM-1基因构建重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP的方法，包括以下步骤：1)MGTM-1基因片段的扩增与T-A克隆；2)构建重组穿梭质粒pDC315-TM-1-EGFP；3)在HEK293细胞中重组和包装病毒pBH-TM-1-EGFP。具体包括步骤如下：1)从MGS6株中扩增出TM-1基因序列GI：S65869.1；所述的TM-1基因的扩增包括：以TM-1-FSEQIDNO.1和TM-1-RSEQIDNO.2为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；2)将TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315-TM-1-EGFP；3)将重组穿梭质粒pDC315-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-TM-1-EGFP。如所述的MGTM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。如所述的MGTM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防鸡慢性呼吸道疾病疫苗中的应用。也就是说：从MGS6株中扩增出目的基因；将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上；经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP连接；利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，经PCR、Westernblot鉴定重组腺病毒；重组腺病毒纯化后，经TCID50方法测定重组腺病毒的滴度；将重组腺病毒和市场弱毒疫苗分别免疫鸡，ELISA检测免疫鸡抗体，免疫攻毒检测免疫鸡的发病率和死亡率，评价研制二联疫苗免疫鸡的效果。下面结合具体实例对本专利技术作进一步详细说明：1材料与方法1.1TM-1基因的扩增收集接种到PPLO液体培养基中的MGS6株菌体，利用饱和酚-氯仿抽提法提取MG的DNA；根据GenBank中MGTM-1基因序列(S65869.1)设计引物，进行PCR扩增目的片段。TM-1基因引物见表1(划线部分为酶切位点，斜体部分为Kozak序列，加粗部分为6×His)，TM-1基因的PCR反应体系见表2。表1扩增TM-1基因片段的引物序列表2TM-1基因PCR反应体系注：反应程序为：94℃，预变性5min；{94℃，变性30s；55℃，退火35s；72℃，延伸1min本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种TM‑1基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从MG S6株中扩增出TM‑1基因序列GI：S65869.1；所述的TM‑1基因的扩增包括：以TM‑1‑F SEQ ID NO.1和TM‑1‑R SEQ ID NO.2为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM‑1基因；2)将TM‑1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315‑MCS‑EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315‑TM‑1‑EGFP；3)将重组穿梭质粒pDC315‑TM‑1‑EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH‑TM‑1‑EGFP。
【技术特征摘要】
1.一种TM-1基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从MGS6株中扩增出TM-1基因序列GI：S65869.1；所述的TM-1基因的扩增包括：以TM-1-FSEQIDNO.1和TM-1-RSEQIDNO.2为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；2)将TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC31...
【专利技术属性】
技术研发人员：金天明，张东超，李小慧，高珂珂，弓建芳，林静，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津;12
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