一种鉴定棉花苗期耐盐性的方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定棉花苗期耐盐性的方法，利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子流，同时结合盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。本发明专利技术以4个耐盐性差异显著的棉花品种为材料，利用沙壤土为培养基质，种植在人工培养箱中，研究盐协迫下各品种各项生理指标，同时采用非损伤微测技术和qRT‑PCR技术，测定了盐胁迫条件下Na+离子流以及Na+运转基因GhSOS1的变化情况。结果表明，盐胁迫下不同耐盐性棉花品种在Na+吸收动态变化趋势上具有明显差异，可以利用Na+离子流以及Na+平衡相关基因的差异快速、准确地鉴定棉花品种的耐盐性，具有一定的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及电生理学、分子生物学和植物遗传育种领域，具体地说，涉及一种鉴定棉花苗期耐盐性的方法。
技术介绍
盐碱地及次生盐碱地已成为世界性问题，是限制作物生长及产量的重要因素。我国是世界盐碱地大国之一，盐渍化土壤面积约占我国现有耕地的1/4，并且面积不断扩大，已严重威胁着我国的粮食安全和生态环境，因此准确了解植物对盐胁迫的生理响应已成为人们日益关注的焦点(萨如拉等，2014)。棉花是耐盐性较强的作物之一，它以其较好的耐盐性逐渐成为盐碱地一种新的优势作物。目前，我国已成为世界上盐碱地植棉规模最大的国家，据不完全统计，我国植棉区内盐碱地约有1.7×108hm2，其中2.7×106hm2先后开发植棉(刘雅辉等，2014)，因此提高和改良棉花品种的抗盐碱能力已经成为棉花育种中重点目标，而建立棉花耐盐简便的鉴定方法对于耐盐性育种显得尤为重要。而从丰富的棉花品种资源中筛选鉴定适合在盐碱地开发的耐盐品种显得尤为重要，建立简便快速的耐盐性鉴定方法则是棉花耐盐品种选择和育种研究的基础。耐盐性的鉴定评价方法很多(刘国强等，1993；孙小芳等，2001；张国伟等，2011；王俊娟等，2011)，如发芽期筛选法、苗期鉴定法、营养液筛选法、大田鉴定法等；但大多耐盐性鉴定方法复杂，测定周期长，且实际利用过程中由于处理条件、评价指标和分级标准的差异，往往导致同一材料耐性级别不同，限制了在实际生产中的应用(张鹏等，2013；姜静涵等，2013；彭振等，2014；刘学等，2015)。因此，建立一种操作简单、指标明确的鉴定方法对于我国棉花种质资源的快速筛选具有重要意义。盐分协迫对植物的伤害主要是通过离子胁迫，使细胞质膜损伤，选择透性破坏，近年来关于盐胁迫下离子的吸收与积累的研究越来越受到重视。一些研究认为，许多植物能够忍耐土壤中高浓度的盐分，主要和植物自身在盐渍环境中维持细胞质中较低的Na+含量有关(Haqetal.2002；Takahashietal.2007)；在高盐条件下，促进Na+外排是减低植物细胞质中Na+含量的重要策略(Chinnusamyetal，2005)。Na+的外排主要依靠位于质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)来完成(Zhu，2003)，SOS1把细胞内的Na+分别泵到胞外，从而降低细胞质中的Na+浓度，进而减少Na+对细胞质中细胞器的毒害(Blumwald，2000；Heetal，2015)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定棉花苗期耐盐性的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的鉴定棉花苗期耐盐性的方法，利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子流，同时结合盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。本专利技术方法中，棉花幼苗的耐盐性与胚轴中Na+离子流呈负相关(偏相关系数为-0.77)，与叶肉组织中Na+离子流呈正相关(偏相关系数为0.45)。在盐胁迫48h内，GhSOS1基因的表达呈先增加后降低的单峰曲线变化，且在盐胁迫12-18h内品种间差异显著；棉花幼苗的耐盐性与胚轴中GhSOS1基因的表达呈负相关(偏相关系数为-0.69)，与叶肉组织中GhSOS1基因的表达呈正相关(偏相关系数为0.53)；且GhSOS1基因的表达水平与Na+离子流呈正相关。本专利技术所述棉花种质材料包括但不限于中571、中棉所49、中棉所44和新陆中61。前述方法中，棉花种子经消毒处理，用水漂洗后，在水中浸种催芽直至露白，然后播种于沙壤土中培养至三叶期，进行盐胁迫处理，然后利用非损伤微测技术测定棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子流，同时利用qRT-PCR法测定胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达水平，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。本专利技术的鉴定棉花苗期耐盐性的方法具体包括以下步骤：1)棉花种子用9％的双氧水消毒30min，用水漂洗数次后用去离子水浸种催芽直至露白，播种于灭菌的沙壤土中培养至三叶期，进行盐胁迫处理，使其土壤终含盐量为0.3％；为保持土壤中的水分及营养，每隔两天浇100mL水，每隔5天浇100mLHoagland营养液；2)盐胁迫处理9天后，利用非损伤微测技术测定棉花幼苗胚轴及叶肉组织Na+离子流速，具体如下：从幼苗子叶节处切去地上部枝叶部分，保留地下部作为胚轴样品，切取第三叶片的中间部位作为叶肉组织样品；将测定的样品用去离子水冲洗干净，并将其浸没在蒸馏水中15min，浸入100mL测试液中平衡15min，再转入新的100mL测试液中开始测试；测试部位距样品位置300μm处；测试持续7-10min，舍弃前2-3min的数据；其中，所述测试液配方为：0.1mmolL-1KCl、0.1mmolL-1CaCl2、0.3mmol·L-1MES，pH6.0；3)盐胁迫处理9天后，利用qRT-PCR法测定胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达水平，以GhUBQ7基因作为内参；设计的qRT-PCR特异性引物分别为：GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；以及GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′；4)根据步骤2)和3)的分析结果，区分出耐盐性差异的棉花种质材料。步骤1)中培养条件为：光照强度400μmolm-2s-1，光照/黑暗时长为14h/10h，光照时的培养温度为30±2℃，黑暗时的培养温度为20±2℃。步骤3)qRT-PCR的反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃35s，40个循环；反应体系为：2×UltraSYBRMixture(WithROX1)10μl,正向引物0.4μl,反向引物0.4μl,DNA模板0.8μl,RNase-FreeWater8.4μl。本专利技术进一步提供所述方法在筛选耐盐性棉花品种中的应用。本专利技术首次利用非损伤微测技术测定棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子的动态变化情况(而常规方法是测定根系中Na+离子变化)，结果表明，幼苗的耐盐性与胚轴中Na+离子流呈反比，与叶肉组织中Na+离子流呈正比，可以有效地区分耐盐性差异的棉花种质材料。同时，本方法还从基因水平上研究盐胁迫下胚轴和叶肉组织中GhSOS1的表达情况。结果表明，在盐胁迫48h内，GhSOS1的表达呈先增加后降低的单峰曲线变化，且在盐胁迫12-18h内品种间差异较大；幼苗的耐盐性与胚轴中GhSOS1的表达呈反比，与叶肉组织中GhSOS1的表达呈正比，从基因角度进一步明确不同种质间耐盐性的遗传背景差异。利用本专利技术方法，根据盐胁迫下不同耐盐性棉花品种在Na+吸收动态变化趋势上的明显差异，可以利用Na+离子流以及Na+平衡相关基因的差异快速、准确地鉴定棉花品种的耐盐性，具有一定的实用价值，是一种稳定高效简便的棉花苗期耐盐性鉴定的方法。附图说明图1为本专利技术实施例中利用SIET技术测定棉花幼苗的胚轴(a)和叶肉(b)组织中Na+离子流的示意图。图2为本专利技术实施例中盐胁迫下不同棉花幼苗的光合速率变化情况；其中，标以不同字母的柱值在P<0.05水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定棉花苗期耐盐性的方法，其特征在于，利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子流，同时结合盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定棉花苗期耐盐性的方法，其特征在于，利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子流，同时结合盐胁迫下棉花幼苗胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，棉花幼苗的耐盐性与胚轴中Na+离子流呈负相关，与叶肉组织中Na+离子流呈正相关。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在盐胁迫48h内，GhSOS1基因的表达呈先增加后降低的单峰曲线变化，且在盐胁迫12-18h内品种间差异显著；棉花幼苗的耐盐性与胚轴中GhSOS1基因的表达呈负相关，与叶肉组织中GhSOS1基因的表达呈正相关；且GhSOS1基因的表达水平与Na+离子流呈正相关。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述棉花种质材料包括中571、中棉所49、中棉所44和新陆中61。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，棉花种子经消毒处理，用水漂洗后，在水中浸种催芽直至露白，然后播种于沙壤土中培养至三叶期，进行盐胁迫处理，然后利用非损伤微测技术测定棉花幼苗胚轴和叶肉组织中Na+离子流，同时利用qRT-PCR法测定胚轴和叶肉组织中GhSOS1基因的表达水平，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)棉花种子用9％的双氧水消毒30min，用水漂洗数次后用去离子水浸种催芽直至露白，播种于灭菌的沙壤土中培养至三叶期，进行盐胁迫处理，使其土壤终含盐量为0.3％；为保持土壤中的水分及营养，每隔两天浇100mL水，每隔5天浇100mLHoagland营养液；2)盐胁迫处理9天后，利用非损伤微测技术测定棉花幼苗胚轴及叶肉组织Na+离子流速，具体如下：从幼苗子叶节处切去地上...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宁，严根土，石建斌，许庆华，周红，苏桂兰，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41