本发明专利技术公开了一种二肽酶突变体及其编码基因和应用。本发明专利技术以一种具有水解有机磷化合物混杂活性的海洋细菌二肽酶OPAA4301(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)为蛋白质工程改造起点，运用定点饱和突变和组合突变技术改造其底物结合相关位点，获得有机磷化合物水解活性提高的二肽酶突变体；其为二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F、H343I、L225Y/H226L或L225Y/H226L/H343I。水解对氧磷最优二肽酶突变体D45W/H226G的催化速率常数相较于野生型二肽酶OPAA4301提高了30.68倍；水解甲基对硫磷最优二肽酶突变体L225Y/H226L/H343I的催化速率常数相较于野生型二肽酶OPAA4301提高了8837.71倍。本发明专利技术的二肽酶突变体可高效水解对氧磷、甲基对硫磷等常见有机磷化合物污染物，在有机磷化合物污染修复领域具有良好应用前景。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种二肽酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
：有机磷化合物属于磷酸酯或磷酸硫醇类衍生物。世界首例有机磷化合物四乙基焦磷酸酯于1937年被人工合成，二战期间沙林、索曼等有机磷化合物曾被用作化学武器，而在现代有机磷被作为农药、石油添加剂、增塑剂、阻燃剂等在工农业中广泛使用。以农药为例，目前有机磷类农药有100余种，占世界农药总使用量的38％。我国是农药生产和使用大国，2015年化学农药原药年产量达374万吨，其中有机磷农药占近一半，我国有机磷类农药使用量约每年8万吨。有机磷化合物能与乙酰胆碱酯酶等受体蛋白丝氨酸特异结合，对高等动物具有强神经毒性。人类活动持续过度使用的有机磷化合物经地表径流和土壤渗漏进入江河，最终汇入海洋，可显著影响微藻、甲壳类动物、棘皮动物和鱼类的生长发育。有机磷污染已成为全球性环境问题，有机磷化合物残留在土壤、河流、江河入海口、近岸海洋等区域被广泛检测到，并对人类健康造成威胁，据估计每年有近300万起因摄入有机磷化合物引发的中毒事件。微生物彻底矿化有机磷化合物转变为能量需经历水解、氧化等多步反应，其中对磷氧烷基或磷氧芳基酯键的水解是有机磷化合物解毒最为关键的一步，而此步反应由微生物体内的有机磷水解酶催化。有机磷水解酶，亦称磷酸三酯酶(EC3.1.8)，该类酶包含两个亚类：一是芳二烷基磷酸酯酶(EC3.1.8.1)，倾向水解含P-O的有机磷酸三酯类化合物；另一类是二异丙基氟磷酸水解酶(EC3.1.8.2)，倾向水解含P-F或P-CN键的有机磷酸酯类化合物。目前研究较多的微生物有机磷水解酶主要包括三类：有机磷水解酶(organophosphorushydrolase，OPH)、甲基对硫磷水解酶(methylparathionhydrolase，MPH)和有机磷酸酐酶(organophosphorousacidanhydrolase，OPAA)。OPH，MPH和OPAA在结构上无相似性，但都是二价金属酶，依靠金属离子去质子化水分子实现对磷酸酯键的攻击。有机磷水解酶降解有机磷类异型生物质的活性均来自具有其他功能的常见蛋白结构域。OPH属于氨基水解酶超家族，具有典型的(α/β)8桶结构；MPH属于β-内酰胺酶超家族，能高效水解甲基对硫磷，该类酶仅在中国发现；OPAA来源于肽酶M24B家族，该家族蛋白羧基端都由保守的皮塔饼结构构成。OPH和MPH都能水解信号分子高丝氨酸内酯，内酯酶活性是对氧磷酶活性的102-106倍，提示这两类有机磷水解酶由细菌群感效应调节蛋白进化而来。已鉴定的OPAA一级结构与脯氨酸二肽酶高度同源，这类肽酶在细菌体内参与胶原蛋白利用过程，介导脯氨酸的释放，为微生物体提供营养，而有机磷水解酶是其混杂活性，通常对含有P＝S键的有机磷类化合物催化活力极微弱，利用蛋白质工程技术改良这类肽酶可增强该酶水解有机磷化合物的能力，使其成为有机磷类污染物修复工具酶源。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术中二肽酶OPAA4301对有机磷化合物水解活力较弱的不足，提供了一类水解有机磷化合物活性提高的二肽酶突变体及其编码基因和应用。专利技术人从分离自南海沉积物(18°0’N，109°42′E，-63m水深)的假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)SCSIO04301中鉴定一条编码假定二肽酶OPAA4301(GenbankaccessionNO.WP_036973676)的基因opaa4301(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)，对应的氨基酸序列(如SEQIDNO.1所示)与大肠杆菌来源的M24家族脯氨酸二肽酶PepQ(PDBcode:4QR8)的氨基酸一致性达51％，体外活性表征表明该基因合成的二肽酶OPAA4301同时具有水解对氧磷(kcat/Km＝(0.935±0.089)×103M-1s-1)和二肽底物Gly-Pro(kcat/Km＝(7.684±1.242)×104M-1s-1)活性，催化二肽底物的能力是对氧磷的近100倍。与此同时对含有P＝S键的有机磷类化合物催化活力极微弱(kcat/Km＝1.24±0.01M-1s-1)。本专利技术针对现有技术中二肽酶OPAA4301对有机磷化合物水解活力较弱的不足，利用基因突变技术改造二肽酶OPAA4301以提高其水解有机磷化合物的活性，进而提供了系列水解对氧磷和甲基对硫磷活性提高的二肽酶突变体及其编码基因，含有二肽酶突变体编码基因的重组表达载体和含有该重组表达载体的重组菌及其制备方法，以及二肽酶突变体在水解有机磷化合物及修复有机磷化合物污染中的应用。二肽酶OPAA4301的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该二肽酶OPAA4301同时具有二肽酶和有机磷水解酶活性，对有机磷农药对氧磷和甲基对硫磷的催化速率常数(kcat/Km)分别为(0.935±0.089)×103M-1s-1和1.24±0.01M-1s-1。为提高二肽酶OPAA4301对对氧磷和甲基对硫磷的水解活性，专利技术人通过对其底物结合相关的区域(小底物结合口袋、大底物结合口袋和离去结合位点)氨基酸进行蛋白质工程改造技术，分别以上述两种农药为底物从突变文库中筛选有益突变体，并对有益突变进行组合。本专利技术的第一个目的是提供一类水解有机磷化合物活性提高的二肽酶突变体，其特征在于，其为二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F、H343I、L225Y/H226L或L225Y/H226L/H343I；所述的二肽酶突变体D45W，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体H226G，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体Y292F/L366F，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第292位酪氨酸和第366位亮氨酸同时替换为苯丙氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/H226G，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/Y292F/L366F，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/H226G/Y292F/L366F，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种二肽酶突变体，其特征在于，其为二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F、H343I、L225Y/H226L或L225Y/H226L/H343I；所述的二肽酶突变体D45W，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体H226G，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体Y292F/L366F，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第292位酪氨酸和第366位亮氨酸同时替换为苯丙氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/H226G，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/Y292F/L366F，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/H226G/Y292F/L366F，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体H343I，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第343位组氨酸替换为异亮氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体L225Y/H226L，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第225位亮氨酸替换为酪氨酸，同时第226位组氨酸替换为亮氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体L225Y/H226L/H343I，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第225位亮氨酸替换为酪氨酸，同时第226位组氨酸替换为亮氨酸，同时第343为组氨酸替换为异亮氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同。...
【技术特征摘要】
1.一种二肽酶突变体，其特征在于，其为二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F、H343I、L225Y/H226L或L225Y/H226L/H343I；所述的二肽酶突变体D45W，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体H226G，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体Y292F/L366F，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第292位酪氨酸和第366位亮氨酸同时替换为苯丙氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/H226G，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/Y292F/L366F，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体D45W/H226G/Y292F/L366F，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同；所述的二肽酶突变体H343I，与SEQIDNO.1所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙丽娟，杨键，肖运柱，田新朋，李洁，张偲，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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