本发明专利技术涉及微生物、分子生物学领域，具体涉及一种菌株、其构建方法及其发酵应用。本发明专利技术使用高拷贝游离型质粒pYX212为载体，在酿酒酵母菌株中过表达来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH，利用酿酒酵母内源启动子TEF1、PGK1对XDH的酶活进行调节，得到能够提高木糖、葡萄糖共利用中木糖消耗速率的重组酿酒酵母菌株。本发明专利技术分子操作简单，无需通过定点突变或长期的进化过程，就可以初步实现木糖、葡萄糖的共利用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物、分子生物学领域，具体涉及一株利用木糖酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
目前，乙醇的生产主要通过淀粉或者一些农作物中的蔗糖，比如玉米、甘蔗和甜菜。出于经济和环境方面的考虑，利用农业废物和其他一些低成本的碳水化合物原料进行生物乙醇的生产得到广泛关注，包括玉米秸秆、甘蔗渣、麦秸、不可回收利用纸张以及柳枝稷。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素、果胶和木质素组成，主要的糖成分是葡萄糖，但是含有20％的戊糖，比如D-木糖和L-阿拉伯糖。用木质纤维素原料生产生物乙醇近年来获得了广泛关注，因为和以淀粉和蔗糖为主的原料相比，这种原料量多且便宜。酿酒酵母，是工业上利用己糖生产生物乙醇的首选微生物，但是它本身不能利用D-木糖(木质纤维素水解液的第二大成分)。在过去的20年里，学者们对酿酒酵母利用木糖产乙醇进行了大量研究，主要集中在对细菌和真菌木糖利用基因的功能表达和对PP途径的操作上，来加强酿酒酵母对木糖的利用和发酵。微生物中木糖代谢的途径有三条，但是目前仅有两条被引入酿酒酵母中。细菌通过木糖异构酶途径(XI)将木糖直接转化为5-木酮糖。尽管XI途径不需要吡啶核酸辅因子，但是许多原核生物的XI(由xylA编码)在酿酒酵母中表达后都没有活性。这可以归因于许多原因，包括蛋白错误折叠、翻译后修饰错误、不正确的二硫键形成、不良的内部pH和特定金属离子的缺失。丝状真菌和一些酵母通过一个包含两步反应的氧化还原途径来代谢木糖。首先，由XYL1编码的NAD(P)H依赖型木糖还原酶(XR)将木糖还原成木糖醇；然后，由XYL2编码的NAD+依赖型木糖醇脱氢酶将木糖醇氧化成5-木酮糖。尽管在酿酒酵母中发现了编码XR和XDH的同源基因，但是酿酒酵母不能单独利用木糖生长。过表达酿酒酵母自身的醛糖还原酶和木糖醇脱氢酶，虽然菌体能以木糖生长，但是生长速率非常低。在这一内源木糖代谢途径被发现之前，人们就已经开始在酿酒酵母中引入能够利用木糖的酵母中的木糖代谢途径。树干毕赤酵母的XR/XDH途径在木糖发酵酿酒酵母的改造中是应用最为广泛的，尽管它有一个很严重的问题，XR偏好NADPH，XDH严格依赖NAD+。辅因子的不平衡导致木糖醇的分泌，使得工程菌碳利用和乙醇产量减少。为此学者们进行了很多尝试，用了很多方法来缓解辅因子不平衡的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题时提供一株共利用木糖和葡萄糖的的酿酒酵母重组菌，以提高酿酒酵母发酵过程中木糖利用率。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母的构建方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母在发酵中的应用。一株能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，在酿酒酵母菌中导入了来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH。其中，所述的酿酒酵母菌为S.cerevisiaeBY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。其中，所述的木糖还原酶XR，其核苷酸序列如SEQIDNO.：1所示，所述的木糖醇脱氢酶XDH其核苷酸序列如SEQIDNO.：2所示。其中，所述的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH的基因的启动子为TEF1或PGK1；所述TEF1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.：3所示；所述PGK1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.：4所示；优选木糖还原酶XR的启动子为TEF1启动子，XDH的启动子为PGK1启动子。其中，所述木糖还原酶XR基因和木糖醇脱氢酶XDH的基因的3’端克隆有终止子，所述终止子的核苷酸序列如SEQIDNO.：5所示。上述能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：用overlapPCR得到包含启动子、目的基因、终止子的DNA片段，将该DNA片段克隆到pYX212质粒上，得到重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒转化酿酒酵母菌。上述能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵中的应用。其中，发酵培养基中，木糖与葡萄糖的质量比例为1:5～5:1，优选质量比为2：1其中，发酵前，种子培养培养条件如下：培养温度为30℃，培养时间为20-24h，转速为200rpm，种子培养基的包括：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，初始pH5.2，溶剂为水；发酵时，发酵培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为40～108h，转速为200rpm，发酵培养基的组分包括：葡萄糖10～50g/L，木糖10～50g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5具体的培养方法如下：用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5mlYPD液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。一级种子培养结束后，转接于装有100mlYPD液体培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。培养基成分：种子培养基的组分为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，初始pH5.2。发酵培养基的组分为：葡萄糖10-50g/L，木糖10-50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，初始pH5.2。培养基灭菌条件：115℃，20min。有益效果：与现有技术相比，本专利技术在单倍体酿酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)中用酿酒酵母内源启动子TEF1、PGK1p以表达载体组成型高拷贝质粒pYX212过表达来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR(由XYL1编码)和木糖醇脱氢酶XDH(由XYL2编码)，得到能木糖利用菌株XR-pXDH。该方法应用常用组成型高拷贝质粒pYX212在酿酒酵母菌株中过表达木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH，能够实现在混糖发酵过程中提高木糖、葡萄糖共利用过程中木糖的消耗速率。本专利技术分子操作简单，无需经过长期的进化过程，是解决木糖利用重组酿酒酵母中普遍存在的木糖消耗速率低下问题的一种尝试。附图说明图1以启动子TEF1p分别过表达XR和XDH质粒载体图谱；其中，XR的启动子为TPI1p，终止子为CYCt，XDH的启动子为TPI1p，终止子为CYCt，所用表达质粒为组成型高拷贝质粒pYX212。图2以启动子TEF1p过表达XR，以启动子PGK1p过表达XDH质粒载体图谱；其中，其中，XR的启动子为TPI1p，终止子为CYCt，XDH的启动子为TPI1p，XDH的启动子为PGK1p，终止子为CYCt，所用表达质粒为组成型高拷贝质粒pYX212。图3CON，Ctp与XR-XDH以葡萄糖为碳源时葡萄糖消耗(A)、菌体生长(B)、乙醇产生(C)情况。图4CON，Ctp与XR-XDH以葡萄糖、木糖混合糖为碳源时葡萄糖、木糖消耗(A)、菌体生长(B)、木糖醇积累(C)、乙醇产生(D)情况。图5XR-XDH与RH-TAL，RH-XK以葡萄糖为碳源时葡萄糖消耗(A)、菌体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，在酿酒酵母菌中导入了来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH。
【技术特征摘要】
1.一株能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，在酿酒酵母菌中导入了来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH。2.根据权利要求1所述的能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的酿酒酵母菌为S.cerevisiaeBY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。3.根据权利要求1所述的能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的木糖还原酶XR，其核苷酸序列如SEQIDNO.：1所示，所述的木糖醇脱氢酶XDH其核苷酸序列如SEQIDNO.：2所示。4.根据权利要求1所述的能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH的基因的启动子为TEF1或PGK1；所述TEF1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.：3所示；所述PGK1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.：4所示。5.根据权利要求4所述的能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的木糖还原酶XR的基因的启动子为TEF1，所述的木糖醇脱氢酶XDH的基因的启动子为PGK1。6.根据权利要求4所述的能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述木糖还原酶XR...
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，邹亚男，施欣驰，陈勇，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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