本发明专利技术涉及基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法，用分子印迹膜‑石英晶体微天平组成的传感阵列同时检测克伦特罗及其在猪尿液内的代谢产物3,5‑二氯‑对氨基扁桃酸和3,5‑二氯‑对氨基马尿酸。与现有技术相比，MIP‑QCM传感器检出限低即3μg/L，低于国际食品法典委员会规定上限10μg/L；其次稳定，在稳定实验中，前14次是稳定的从第15次测试开始，测试结果逐步上升，至20次时，测试结果为约为初始状态的二分之一；最后是快速准确，MIP‑QCM传感器阵列分别检测对三种溶液，并用主成分分析法对响应值聚类分析，可得到100％识别率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全快速检测技术，尤其是涉及一种基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法,可为研制快速检测瘦肉精类组分的智能电子舌提供传感器阵列支持。
技术介绍
当前，声波传感器已经可以针对性的检测某种目标待测物，该技术已广泛应用于环境检测，化学物质生产和有机物合成等领域。近来，出现了将多个具有特异性识别能力的传感器组合成一个阵列，来对目标溶液进行检测。传感器阵列通常被应用于生物学系统，用于检测气味。传感器阵列方法的最大优势在于它能够将一些选择性不太好，交叉反应严重的传感器元件变成具有高选择性和识别性能的一组传感器。例如，早期的传感器阵列由一些不具有任何固有识别的能力的简单传感器元件组成，但尽管有如此多的限制，传感器阵列的方法仍然是极为有效的，甚至应用于电极鼻或电子舌得以商业化生产。传感器阵列方法的局限在于它需要足够多数量的具有特异识别性能的传感元件，但是，即使是制备一个特异性的生物或者化学的接收装置都是一项需要大量时间和资源的复杂工作，而传感器阵列需要众多这样的传感器，更增加了制备的难度。分子印迹技术的逐渐成熟让人们看到了解决这一问题的希望。这种可以基于不同种类特定分子模板进行合成的方法使得同时快速制备具有不同特异识别性能的传感器成为可能。由于MIP方法的灵活性，基于MIP的传感器阵列也可以针对某种目标物质进行制备，进而可以更加准确的识别该物质。克伦特罗是一种β2-肾上腺素受体激动剂。它可以用于扩张支气管和保胎，也可以治疗呼吸系统疾病，此外由于它还具有促进生长、提高瘦肉率和减少脂肪的作用，因此被一些不法商贩添加入食用性畜产动物饲料中作为瘦肉精使用。人类摄入克伦特罗可能会导致食物中毒，包括肌肉震颤，心动过速，心悸，头晕，严重时甚至会死亡。因此，世界许多国家，如中国，欧盟，墨西哥等已经明文禁止在动物饲料中添加克伦特罗。然而，非法滥用瘦肉精却从来没有停止过，我国相继爆发的“瘦肉精”事件，引起了社会对克伦特罗残留量的极大关注。当前有多种方法可以检测克伦特罗，包括诸如免疫学技术的酶联免疫法(ELISA)，气相色谱—质谱联用法(GC-MS)，高效液相色谱法(HPLC)，免疫层析等。其中，GC-MS和HPLC法可以进行精确测量，但其存在仪器成本高，分析速度慢等缺点；ELISA方法是最常用的定性筛选技术，但其存在假阳性，据报道检测市面上常见的38种兽药中，24％会产生假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速准确、可得到100％识别率的基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法，采用以下步骤：(1)使用分子模拟软件Hyperchem7.5确定模板分子与功能单体的最佳比例；(2)制备分子印迹膜-石英晶体微天平(MIP-QCM)系统；(3)在分子印迹膜-石英晶体微天平系统的基础上，建立声波传感器检测系统；(4)利用声波传感器检测系统测定MIP-QCM单一性能和三种MIP-QCM组合性能，对猪尿液中克伦特罗的含量进行检测。步骤(1)采用以下步骤：(1-1)画出模板分子、功能性单体的2D结构，然后将其转化成3D分子模型，经分子力学方法和半经验量化方法优化两步优化；(1-2)计算后得到模板分子能量，功能单体能量和各自的电荷分布，再将不同比例的模板分子和功能单体根据电荷分布和氢键规则进行摆放，再依次用分子力学方法和半经验量化方法得到复合物最低能量构象，通过比较不同比例条件下的能量变化，来确定模板分子和功能单体的最佳比例。步骤(2)采用以下步骤：(2-1)用Piranha溶液清洗石英晶体微天平(QCM)的金电极；(2-2)洗净的电极置于9.0-10.0mmol/L的11-巯基十一烷酸乙醇溶液中在20℃下浸泡24h巯基自组装至金电极表面；(2-3)分别用乙醇和去离子水清洗去除未自组装至金电极表面的残留11-巯基十一烷酸；将完成自组装操作的QCM晶片置于9.0-10.0mmol/L伍德沃德氏试剂K水溶液中，浸泡30min，活化羧基，用去离子水冲洗，氮气吹干；(2-4)在氮气保护和冰浴条件下，将QCM晶片置于9.0-10.0mmol/L,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)，0.20-0.30mmol/L对二甲氨基吡啶和0.95-1.05mmol/L二环己基碳二亚胺的甲醇溶液中，待逐渐升至室温后，反应5h，然后依次用甲醇，丙酮，乙醚小心清洗，去除未反应物质，氮气吹干；(2-5)取0.20-0.30mmol/L克伦特罗溶液、7.0-8.0mmol/L丙烯酰胺溶液/2.0-3.0mmol/L4-羟基扁桃酸溶液、7.0-8.0mmol/L克伦特罗溶液/2.0-3.0mmol/L对氨基马尿酸溶液、12.0-13.0mmol/L克伦特罗溶液溶于乙腈溶液中，超声脱气10min，加入乙二醇二甲基丙烯酸脂，放入金电极，氮气保护条件下65℃回流反应12h。步骤(3)中的声波传感器检测系统包括置于流动池内的分子印迹膜-石英晶体微天平系统，与分子印迹膜-石英晶体微天平系统连接的一体化矢量网络分析仪，经管道与流动池连接待测液盛装装置及废液收集装置，所述的管道上连接有蠕动泵。步骤(4)中MIP-QCM单一性能测试采用以下步骤：a.绘制标准曲线，即配置梯度浓度1×10-1、1×10-2、3.2×10-3、1×10-3、3.2×10-4、1×10-4、3.2×10-5、1×10-5mmol/L的CL乙醇溶液，将其通过相应的以CL为分子模板制备的MIP-QCM，使用矢量网络分析仪进行检测，每10min记录实验数值。每个浓度重复3次，每次测试后用依次用洗脱液(甲酸/乙酸，9:1，v/v)和去离子水清洗电极和管道至QCM频率接近初始数值。b.MIP-QCM与NIP-QCM对比试验，将1×10-3mmol/L的克伦特罗乙醇溶液依次通过基于CL制备的MIP-QCM和NIP-QCM，使用矢量网络分析仪进行测试每分钟记录下相应的频率数值，持续10min，重复三次。c.MIP-QCM使用次数测试，1×10-3mmol/L的克伦特罗乙醇溶液重复通过同一个基于CL制备的MIP-QCM，使用矢量网络分析仪进行测试，检测使用次数对传感器的影响。记录下10min时的声波频率数值。d.单一传感器对不同溶液的响应情况，配置1×10-3mmol/L的克伦特罗、对氨基马尿酸和4-羟基扁桃酸的乙醇溶液，依次使用这三种模板分子制备的MIP-QCM分别测量三种溶液，每分钟记录下相应的声波频率数值，持续10min，重复5次试验。e.传感器阵列性能测试，将以CL/HMA/AHA为分子模板制备的MIP-QCM三种传感器组成阵列，分别使1×10-3mmol/L的克伦特罗、对氨基马尿酸和4-羟基扁桃酸的乙醇溶液通过该阵列，同时记录下三种声波传感器的响应数值，每一种溶液重复进样5次。之后，使用主成分分析的方法对三种溶液通过传感器阵列时的响应数据进行分析。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术是一种新的方便廉价的声波传感检测器。本专利技术的元件传感器，相对于传统基于电位、电流、光学性或声学特性化学传感器，具有廉价，耗时短的优点。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：(1)使用分子模拟软件Hyperchem 7.5确定模板分子与功能单体的最佳比例；(2)制备分子印迹膜‑石英晶体微天平(MIP‑QCM)系统；(3)在分子印迹膜‑石英晶体微天平系统的基础上，建立声波传感器检测系统；(4)利用声波传感器检测系统测定MIP‑QCM单一性能和三种MIP‑QCM组合性能，对猪尿液中克伦特罗的含量进行检测。
【技术特征摘要】
1.基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：(1)使用分子模拟软件Hyperchem7.5确定模板分子与功能单体的最佳比例；(2)制备分子印迹膜-石英晶体微天平(MIP-QCM)系统；(3)在分子印迹膜-石英晶体微天平系统的基础上，建立声波传感器检测系统；(4)利用声波传感器检测系统测定MIP-QCM单一性能和三种MIP-QCM组合性能，对猪尿液中克伦特罗的含量进行检测。2.根据权利要求1所述的基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法，其特征在于，步骤(1)采用以下步骤：(1-1)画出模板分子、功能性单体的2D结构，然后将其转化成3D分子模型，经分子力学方法和半经验量化方法优化两步优化；(1-2)计算后得到模板分子能量，功能单体能量和各自的电荷分布，再将不同比例的模板分子和功能单体根据电荷分布和氢键规则进行摆放，再依次用分子力学方法和半经验量化方法得到复合物最低能量构象，通过比较不同比例条件下的能量变化，来确定模板分子和功能单体的最佳比例。3.根据权利要求1所述的基于分子印迹膜的快速检测猪尿液中克伦特罗方法，其特征在于，步骤(2)采用以下步骤：(2-1)用Piranha溶液清洗石英晶体微天平(QCM)的金电极；(2-2)洗净的电极置于8-10mmol/L的11-巯基十一烷酸乙醇溶液中在20℃下浸泡24h巯基自组装至金电极表面；(2-3)分别用乙醇和去离子水清洗去除未自组装至金电极表面的残留11-巯基十一烷酸；将完成自组装操作的QCM晶片置于8-10mmol/L伍德沃德氏试剂K水溶液中，浸泡30min，活化羧基，用去离子水冲洗，氮气吹干；(2-4)在氮气保护和冰浴条件下，将QCM晶片置于8-10mmol/L2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)，0.20-0.30mmol/L对二甲氨基吡啶和1-3mmol/L二环己基碳二亚胺的甲醇溶液中，待逐渐升至室温后，反应5h，然后依次用甲醇，丙酮，乙醚小心清洗，去除未反应物质，氮气吹干；(2-5)取2-3.0mmol/L克伦特罗溶液、7.0-8.0mmol/L丙烯酰胺溶液/2.0-3.0mmol/L4-羟...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵大云，郑建武，冯凡，韩韬，陈景，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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