以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法，首先通过水热法合成出致密、整齐的TiO2纳米线阵列，然后对其改性，改性过程中Mo元素被成功掺杂入TiO2纳米线阵列以促进其电子转移能力；MoS2片也被成功沉积于电极表面；然后将壳聚糖溶液滴加于改性TiO2纳米线阵列电极表面，使用双氨基交联剂BS3将捕获抗体Ab1共价结合于电极表面。同时用水热法制备出圆柱形TiO2一维纳米材料，并将其氨基化，然后用BS3作交联剂将辣根过氧化物酶HRP和信号抗体Ab2共同修饰于TiO2纳米柱表面以得到信号抗体标记物。采用该方法制备所得的电化学免疫传感器能够快速的测定癌胚抗原CEA，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于电化学免疫传感器构建
，具体涉及一种以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器可用于检测癌胚抗原。
技术介绍
：准确、灵敏地检测肿瘤标志物对癌症的筛选、诊断和治疗都起着至关重要的作用。癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展监测和愈后健康评估非常重要,97%的健康成人血清CEA浓度在2.5ngmI-1以下。许多免疫分析法，包括荧光免疫分析、电化学酶免疫分析、化学发光免疫分析、酶联免疫吸附法等均被广泛用于检测肿瘤标记物。在众多免疫分析法中，电化学免疫分析法具有快速、有效和灵敏等特点。随着纳米科学与技术的飞速发展，各种各样的纳米材料，包括碳纳米材料、石墨烯、二氧化硅、量子点、贵金属等被广泛应用于免疫传感器中以提高其分析性能。在众多纳米材料中，TiO2纳米材料由于其优良的化学稳定性、优异的生物相容性、比表面积大、机械性能好、合成方法简便以及环境友好性等优点吸引了广泛的关注。尤其是一维TiO2纳米结构，如TiO2纳米管，被广泛用于光电化学和电化学免疫传感器。Zhi-DaGao等人用TiO2纳米管阵列为传感器支架，用辣根过氧化物酶标记的信号抗体-Au纳米颗粒作信号探针来检测免疫球蛋白浓度。由于TiO2纳米管的显著管状特征——大的表面积和内部空间，此免疫传感器与其他普通平板电极相比，性能得到有效增强。其对兔免疫球蛋白的浓度线性范围为0.1—105ngmL-1，检测限为0.01ngmL-1。尽管有大量的研究关注TiO2纳米线阵列的光电化学性能，但可能由于其导电性较差、比表面积相对较小的缺点，限制了电子转移和生物分子的负载量，因而很少有人将其用于电化学传感器的制备。值得注意的是，据报道，化学掺杂金属离子作为一种高效的方法可以促进TiO2等半导体纳米材料的电荷分离和导电性。例如Wang等人通过水热法制备了W掺杂的TiO2核-壳纳米线阵列。在刻蚀/再生长过程中，W元素被掺杂入TiO2壳内以提高其光电性能。而且电化学阻抗结果还表明W掺杂后，TiO2纳米线阵列导电性显著增强。石墨烯在不同领域的成功应用激发起了制备类似纳米材料的研究兴趣。据报道，MoS2包含一个Mo金属层和两个S层，Mo金属层通过范德华力夹在两个S层之间。由于其独特的几何结构，MoS2成为典型的石墨烯类似物之一。重要的是，MoS2具有与石墨烯近似的优良性能，如优异的电子性能、特殊的光学特性、优良的机械性能以及表面易修饰特点。尽管MoS2在很多领域如晶体管、燃料电池、储能等都得到了广泛应用，但其在电化学传感器方面的应用还很有限。Vasilescu等人制备了一种由MoS2和石墨烯量子点构成的纳米材料用于负载酶分子。碳基丝网印刷电极的导电性在修饰MoS2-石墨烯量子点后大大增强，同时也为漆酶提供了一个生物相容性支架。该漆酶生物传感器对咖啡酸在浓度范围0.38-100uM内有很好的响应，其检测限为0.32μM，灵敏度为17.92nAuM-1。BS3是一种双氨基交联剂，具有水溶性、非裂解性、膜不渗透性等特点，它含有一个末端氨基反应基团（Sulfo-NHS酯基），可与任何含有伯胺基团的分子反应。因此，其广泛应用于生物分子的交联。本专利技术通过两步水热反应制备了三重修饰的TiO2纳米线阵列。具体来说，第一步水热反应制备出TiO2纳米线阵列；第二步实现了同时“刻蚀、掺杂和沉积”，MoS2片沉积在刻蚀/掺杂过的TiO2纳米线阵列表面。然后将壳聚糖溶液滴加在改性后的TiO2纳米线阵列表面，以BS3为氨基交联剂将捕获抗体Ab1共价结合在其表面。水热法还被用于制备圆柱形TiO2纳米柱，BS3也被用于结合HRP和信号抗体以制备示踪标记物。三重改性后的TiO2纳米线阵列的多项性能得到显著提高，并被用作一种新型免疫传感器平台支架。其优点包括：首先，刻蚀加上Mo掺杂有助于促进电子转移，增强导电性；另外，二维薄层MoS2片的沉积不仅能增强导电性，而且能增强电极比表面积，有助于吸附更多的生物分子。因而本专利技术所制备的新型免疫传感器支架具有优良的导电性，大的比表面积，有助于提高检测范围与灵敏度，目前还未见有相关报道。
技术实现思路
：本专利技术目的在于研制一种以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器能够快速地测定癌胚抗原，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法，其包括如下步骤：①三重改性的TiO2纳米线阵列的制备：TiO2纳米线阵列的制备：将13mL浓HCl用15mL去离子水稀释，室温下搅拌5min，加入300μL钛酸丁酯后，继续搅拌15min以得到澄清溶液；将所得澄清溶液与干净的FTO基片一起转移至反应釜内，在150℃下反应12h；冷却至室温，取出FTO基片，用去离子水洗涤并在N2流下烘干，FTO基片上均匀覆盖一层白色薄膜，即为TiO2纳米线阵列；TiO2纳米线阵列的同时“刻蚀、掺杂和沉积”：将30mL超纯水、0.01M盐酸羟胺、0.005M九水硫化钠、0.002M二水钼酸钠、50μL聚乙二醇与上述制备得到的TiO2纳米线阵列一起置于反应釜内，250℃下反应24h，冷却至室温，取出FTO基片，用去离子水洗涤并在N2流下烘干；观察到所得TiO2纳米线阵列上覆盖有一层黑色沉积物，即为MoS2纳米片，该FTO基片记为改性的FTO电极；②信号抗体标记物的制备：TiO2纳米柱的制备：将1.8mL四氯化钛缓慢加入到含19mL超纯水的烧杯中，冰水浴0-5℃下搅拌10min获得白色悬浮液；再加入1.8mL氯仿，继续搅拌10min，然后转入反应釜内，160℃反应12h，冷却至室温，离心收集白色沉淀并洗涤至中性，然后60℃真空干燥12h，即得TiO2纳米柱，室温下储存备用；TiO2纳米柱的氨基化：将100mgTiO2纳米柱置于含20mL乙醇、1mL28%氨水和4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中，室温下搅拌12h以防止TiO2纳米柱沉降，然后离心分离，弃去上清液，所得白色沉淀物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH2-TiO2纳米柱；辣根过氧化物酶︱氨基化TiO2纳米柱︱信号抗体Ab2生物共轭体的制备：将2mgBS3溶解在1mLPBS缓冲液中获得溶液A，然后将3mgNH2-TiO2纳米柱分散于溶液A中，搅拌下加入300μL2mg·mL-1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30min；然后加入20μL含0.5mg·mL-1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4℃下搅拌8h，离心分离，所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室温下封闭30min，最后用PBS缓冲液洗涤后，分散于1.0mL含0.1%牛血清蛋白的PBS缓冲液中，备用，记为HRP︱NH2-TiO2纳米柱︱Ab2；②免疫传感器的构建：首先，将30μL0.3wt%的壳聚糖醋酸溶液滴加在改性的FTO电极表面，室温下自然晾干，然后滴加30μL含2mg·mL-1BS3的PBS缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：①三重改性的TiO2纳米线阵列的制备：TiO2纳米线阵列的制备：将13 mL 浓HCl用15 mL 去离子水稀释，室温下搅拌5 min，加入300μL钛酸丁酯后，继续搅拌15 min以得到澄清溶液；将所得澄清溶液与干净的FTO基片一起转移至反应釜内，在150℃下反应12 h；冷却至室温，取出FTO基片，用去离子水洗涤并在N2流下烘干，FTO基片上均匀覆盖一层白色膜，即为TiO2纳米线阵列；TiO2纳米线阵列的同时“刻蚀、掺杂和沉积”：将30 mL超纯水、0.01 M 盐酸羟胺、 0.005 M 九水硫化钠、0.002 M二水钼酸钠、50μL聚乙二醇与上述制备得到的TiO2纳米线阵列一起置于反应釜内，250℃下反应24 h，冷却至室温，取出FTO基片，用去离子水洗涤并在N2流下烘干；观察到所得TiO2纳米线阵列上覆盖有一层黑色沉积物，即为MoS2纳米片，该FTO基片记为改性的FTO电极；②信号抗体标记物的制备：TiO2纳米柱的制备：将1.8 mL四氯化钛加入到含19 mL超纯水的烧杯中，冰水浴0‑5℃下搅拌10 min获得白色悬浮液；再加入1.8 mL氯仿，继续搅拌10 min，然后转入反应釜内，160℃反应12h，冷却至室温，离心收集白色沉淀并洗涤至中性，然后60℃真空干燥12 h，即得TiO2纳米柱，室温下储存备用；TiO2纳米柱的氨基化：将100 mg TiO2纳米柱置于含20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中，室温下搅拌12h以防止TiO2纳米柱沉降，然后离心分离，弃去上清液，所得白色沉淀物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH2‑TiO2纳米柱；辣根过氧化物酶︱氨基化TiO2纳米柱︱信号抗体Ab2生物共轭体的制备：将2 mg BS3溶解在1 mL PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3 mg NH2‑TiO2纳米柱分散于溶液A中，搅拌下加入300μL 2 mg·mL‑1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30 min；然后加入20μL含0.5 mg·mL‑1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4℃下搅拌8 h，离心分离，所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室温下封闭30 min，最后用PBS缓冲液洗涤后，分散于1.0 mL含0.1% 牛血清蛋白的PBS缓冲液中，备用，记为HRP︱NH2‑ TiO2纳米柱︱Ab2；③免疫传感器的构建：首先，将30μL 0.3 wt% 的壳聚糖醋酸溶液滴加在改性的FTO电极表面，室温下自然晾干，然后滴加30μL含2 mg·mL‑1 BS3的PBS缓冲液并在室温下孵育1 h，然后再滴加30μL 0.38 mg·mL‑1 的捕获抗体Ab1，室温下孵育1 h，再在4℃、100%湿度饱和环境下孵育12h后，分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤，再用20μL封闭缓冲液孵育30 min，最后分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤3 min，4℃下储存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种以三重改性的TiO2纳米线阵列为支架的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：①三重改性的TiO2纳米线阵列的制备：TiO2纳米线阵列的制备：将13mL浓HCl用15mL去离子水稀释，室温下搅拌5min，加入300μL钛酸丁酯后，继续搅拌15min以得到澄清溶液；将所得澄清溶液与干净的FTO基片一起转移至反应釜内，在150℃下反应12h；冷却至室温，取出FTO基片，用去离子水洗涤并在N2流下烘干，FTO基片上均匀覆盖一层白色膜，即为TiO2纳米线阵列；TiO2纳米线阵列的同时“刻蚀、掺杂和沉积”：将30mL超纯水、0.01M盐酸羟胺、0.005M九水硫化钠、0.002M二水钼酸钠、50μL聚乙二醇与上述制备得到的TiO2纳米线阵列一起置于反应釜内，250℃下反应24h，冷却至室温，取出FTO基片，用去离子水洗涤并在N2流下烘干；观察到所得TiO2纳米线阵列上覆盖有一层黑色沉积物，即为MoS2纳米片，该FTO基片记为改性的FTO电极；②信号抗体标记物的制备：TiO2纳米柱的制备：将1.8mL四氯化钛加入到含19mL超纯水的烧杯中，冰水浴0-5℃下搅拌10min获得白色悬浮液；再加入1.8mL氯仿，继续搅拌10min，然后转入反应釜内，160℃反应12h，冷却至室温，离心收集白色沉淀并洗涤至中性，然后60℃真空干燥12h，即得TiO2纳米柱，室温下储存备用；TiO2纳米柱的氨基化：将100mgTiO2纳米柱置于含20mL乙醇、1mL28%氨水和4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中，室温下搅拌12h以防...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小强，霍小鹤，刘培培，朱杰，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41