一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法技术

本发明专利技术提供一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，具体包括脱细胞真皮基质的制备及脱细胞真皮基质的改性。其中脱细胞真皮基质的制备包括以下几个步骤：取皮、脱脂、角蛋白酶处理、脱细胞。本发明专利技术提供的异种脱细胞真皮基质的制备方法，对于细胞成分脱洗干净，且由于物理法脱去细胞，对胞外基质的结构不产生实质性损坏，同时由于采用角蛋白酶和微波解冻的处理方式，使得基质中胶原纤维空间排列更疏松，提高了材料的孔隙率。同时，采用交联方式产生酰胺化反应，将抗菌吸湿基团引入到敷料中，赋予敷料更多的功效。本发明专利技术产品工艺简单，易于实现工业化生产，具有良好的经济社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学皮肤组织工程
，具体涉及一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法。技术背景皮肤是人体最大的器官，也是人体与外界环境设置的第一道防线，其对保护机体内环境的稳定，抵御外界环境的刺激和病原菌入侵起到重要的作用。由于各种原因常常容易导致皮肤缺损，如烧伤、烫伤以及外界各种不可抗力等因素等。而随着社会的发展及人口老龄化程度的加剧，越来越多的人正遭受着由褥创、糖尿病足、血运障碍性溃疡等难愈合创面带来的痛苦。据统计，我国每年烧伤与溃疡患者达1500万，其中需要进行皮肤移植的有350万之多。然而，在临床中，经常面临没有完整或足够的自身皮肤来移植的困境。所以，研究者一直在寻找人体皮肤的替代品。脱细胞真皮基质是一种无细胞成分、免疫活性低、且保留了表皮和真皮间基底膜的材料，可由动物皮肤加工制得，用于移植后可形成真皮面和基底膜面，因而具有广阔的市场应用前景。但由于现有制备技术难以做到既彻底去除脱细胞免疫成分使其免疫原性最低，又完整保留细胞外基质，同时提高其渗透性。因此，突破传统技术的瓶颈，制造出功能多样、结构完整的脱细胞真皮基质是这一产品推广应用急需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有脱细胞真皮基质，尤其对于异种脱细胞真皮基质在临床使用过程中表现出的不足，提供一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法。本专利技术采用的技术方案是：一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，具体包括以下步骤：S1.取皮：选取健康新鲜的哺乳动物皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用质量浓度0.1%的苯扎氯铵溶液浸泡20～40min，消毒杀菌；S2.脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于质量浓度0.1~1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；S3.角蛋白酶处理：将S2所得脱脂后的皮片置于角蛋白酶溶液中反应30~60min，其中角蛋白酶溶液与皮片的质量比为2~5，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.1~0.5%，溶液中SDS的质量浓度0.3~0.6%；S4.脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡5~10min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理3~10min，然后放入质量浓度3%的高渗氯化钠溶液中浸泡10~30min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤36~72h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗12~24h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得异种脱细胞真皮基质。S5.取上述2~10g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀30~60min，然后滴加0.001~0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；S6.向上述混合液中加入总质量为0.04~2g、由海藻酸丙二醇酯和多胺化合物形成的混合物，在37℃下振荡反应12~24h，得到经改性的异种脱细胞真皮基质；S7.取出经改性的异种脱细胞真皮基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得成品。优选地，所述步骤S6的混合物海藻酸丙二醇酯和多胺化合物的摩尔比为（0.8～1.2）：1。优选地，所述的述多胺化合物为乙二胺、丙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺中的一种。本专利技术产品的有益效果为：（1）采用冻融结合微波对细胞的破碎彻底去除真皮细胞。以猪体躯干部位皮肤为原材料，在脱脂后采用低温冻融、微波解冻、阴阳离子清洗液洗脱的方法，使细胞在微波破碎之后，其碎片易与含丰富清水基团的阴阳离子结合，细胞碎片洗脱彻底。（2）高渗透性脱细胞真皮基质的制备技术。选择特殊的化学脱脂方法，将碱与表面活性剂SDS相结合，充分去除脂肪，同时结合后续的微波处理工艺，使真皮基质中胶原纤维束被分散成许多细小的纤维，其空间排列更疏松，纤维束之间产生较大的孔隙，从而提高脱细胞真皮基质的渗透性。（3）引入功能基团对脱细胞真皮基质进行改性。采用特殊的混合物海藻酸丙二醇酯和多胺化合物改性脱细胞猪真皮基质，引入了具有一定吸湿性和抗菌功能的季铵基团，从而赋予脱细胞真皮基质敷料较好的亲水性和抗菌性能。附图说明图1为本专利技术实施例5中电子显微镜观察到的实验组的三维结构与微观形貌；图2为本专利技术实施例5中电子显微镜观察到的对照组的三维结构与微观形貌；图3为本专利技术实施例6中空白样0h接触细菌生长图；图4为本专利技术实施例6中空白样18h接触细菌生长图；图5为本专利技术实施例6中实验组0h接触细菌生长图；图6为本专利技术实施例6中实验组18h接触细菌生长图；图7为本专利技术实施例6中对照组0h接触细菌生长图；图8为本专利技术实施例6中对照组18h接触细菌生长图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明。实施例1一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其制备过程如下：（1）取2g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀30min，然后滴加0.001mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；（2）向上述混合液中加入总质量为2g、由海藻酸丙二醇酯和乙二胺形成的混合物（二者的摩尔比为4：5），在37℃下振荡反应12h，得到经改性的高性能脱细胞真皮基质；（3）取出皮片基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得高性能脱细胞真皮基质敷料。上述步骤中，所述的异种脱细胞真皮基质，其制备工艺过程如下：（1）取皮：选取健康新鲜的猪皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡20min，消毒杀菌；（2）脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于0.1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；（3）角蛋白酶处理：脱脂后的皮样置于角蛋白酶溶液中反应60min，其中液比（用水量与皮样的质量比值）为2，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.1%，溶液中SDS的质量浓度0.4%；（4）脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡5min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理3min，然后放入3%的高渗氯化钠溶液中浸泡15min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤36h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗洗脱液12h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得脱细胞真皮基质材料。实施例2（1）取10g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀60min，然后滴加0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；（2）向上述混合液中加入总质量为0.04g、由海藻酸丙二醇酯和丙二胺形成的混合物（二者的摩尔比为6：5），在37℃下振荡反应24h，得到经改性的高性能脱细胞真皮基质；（3）取出皮片基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得高性能脱细胞真皮基质敷料。上述步骤中，所述的异种脱细胞真皮基质，其制备工艺过程如下：（1）取皮：选取健康新鲜的牛皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡40min，消毒杀菌；（2）脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 取皮：选取健康新鲜的哺乳动物皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用质量浓度0.1%的苯扎氯铵溶液浸泡20～40min，消毒杀菌；S2. 脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于质量浓度0.1~1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；S3. 角蛋白酶处理：将S2所得脱脂后的皮片置于角蛋白酶溶液中反应30~60min，其中角蛋白酶溶液与皮片的质量比为2~5，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.1~0.5%，溶液中SDS的质量浓度0.3~0.6%；S4. 脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡5~10min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理3~10min，然后放入质量浓度3%的高渗氯化钠溶液中浸泡10~30min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤36~72h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗12~24h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得异种脱细胞真皮基质；S5. 取上述2~10g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀30~60min，然后滴加0.001~0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；S6. 向上述混合液中加入总质量为0.04~2g、由海藻酸丙二醇酯和多胺化合物形成的混合物，在37℃下振荡反应12~24h，得到经改性的异种脱细胞真皮基质；S7. 取出经改性的异种脱细胞真皮基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得成品。...

【技术特征摘要】
1.一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取皮：选取健康新鲜的哺乳动物皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用质量浓度0.1%的苯扎氯铵溶液浸泡20～40min，消毒杀菌；S2.脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于质量浓度0.1~1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；S3.角蛋白酶处理：将S2所得脱脂后的皮片置于角蛋白酶溶液中反应30~60min，其中角蛋白酶溶液与皮片的质量比为2~5，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.1~0.5%，溶液中SDS的质量浓度0.3~0.6%；S4.脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡5~10min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理3~10min，然后放入质量浓度3%的高渗氯化钠溶液中浸泡10~30min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤3...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢亢，陈锦涛，庄壮辉，熊亮，
申请(专利权)人：广东泰宝医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44