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一株高效转化植物甾醇的菌株及其应用制造技术

技术编号:14347605 阅读:156 留言:0更新日期:2017-01-04 18:19
本发明专利技术属生物技术领域,涉及一株高效转化植物甾醇的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)LY‑1及其应用,该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.13031。分枝杆菌(Mycobacterium sp.)LY‑1能转化植物甾醇为9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮,在底物投料量为15g/L的条件下,产物得率33%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
,具体涉及一株分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1及其转化植物甾醇为9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法。
技术介绍
9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一类重要的甾体激素类药物的前体,其9位被羟基化的位点,经过简单的卤化反应,便可引入F或者Cl等卤素取代基,从而有效提升某些皮质类激素的药用药效。由于传统化学合成法带来严重的工业污染,且收率低,成本高,极大地限制了其合成的发展,故近年来利用微生物转化逐渐成为主要发展趋势。因此,筛选和富集可以有效积累9α-OH-AD的菌株成为甾药开发研究关注的重点之一。合成9α-OH-AD的传统方法是采用相同或相近的结构母核类似物进行化学合成,但是9α-OH-AD对立体选择性要求高,通常会造成产物得率低,副产物多,产品后续分离纯化过程复杂等问题。近年来,国内外研究者开始考虑生物转化法特异性转化9α-OH-AD,该反应具有条件温和,安全低耗、易操作、转化率高且环境友好等特点。据相关文献报道,目前已有红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)等菌株具备转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为9α-OH-AD的能力。AD与植物甾醇二者均为脂溶性化合物,在水相中溶解度极低,造成转化过程中底物投料浓度和转化效率都非常低,且成本远高于植物甾醇,这些问题直接成为9α-OH-AD工业生产中的瓶颈。因此,筛选一株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的微生物具有非常重要的意义,而目前关于分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1用于转化植物甾醇的研究未见报道,其极高的9α-OH-AD转化纯度更是工业生产的一大优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株高效转化植物甾醇的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1,以及利用该菌株转化植物甾醇为9α-OH-AD的方法,可达到高底物投料浓度、高底物高转化率、高产物得率的要求。本专利技术的专利技术人从国内合成甾体化合物的化工厂厂房周围的土壤样品中分离筛选获得一株分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1,该菌于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.13031,分类命名为分枝杆菌Mycobacteriumsp.。应用上述微生物转化植物甾醇生产9α-OH-AD的方法,其步骤如下:(1)采用保藏号为CGMCCNo.13031的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1为生产菌种,按照常规方法进行活化培养得到种子液,将该种子液涂布到PDA培养基上;(2)制备LY-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的LY-1菌株一环,接种于已灭菌的装有70-110mL种子培养基的500mL锥形瓶中,培养温度为20-35℃,置摇床上以90-150r/min的转速培养60-72h至对数生长中期,即得到LY-1菌株的细胞液体培养物;(3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以0.5-1.2%(w/w)的接种量接入发酵培养基,装液量为500mL锥形瓶中装70-110mL发酵培养基,培养温度为20-35℃,在90-150r/min的转速下培养120-168h,得发酵液。(4)产物检测:将步骤(3)的转化液用等体积乙酸乙酯抽提6次,于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现,乙腈复溶晶体并通过0.22μm的有机膜过滤除杂,滤液利用高效液相色谱法分析9α-OH-AD的含量。其中步骤(1)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200-500g/L;葡萄糖20-50g/L;酵母粉2-10g/L;琼脂粉10-20g/L;pH自然,在121℃高压蒸汽下灭菌20min;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:NaNO32-10g/L,酵母粉5-20g/L,甘油1-5g/L,(NH4)2HPO40.2-1.5g/L,在121℃高压蒸汽下灭菌20min;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:植物甾醇5-20g/L,NaNO32-10g/L,玉米浆5-25g/L,(NH4)2HPO40.2-1.5g/L,pH7.5-8.5,121℃高压蒸汽下灭菌20min。本专利技术所述的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1,菌株首次发现可转化植物甾醇生成9α-OH-AD,并且能达到高底物投料量、高底物转化率、高产物纯度的要求,是一株极具开发研究价值的生产菌株。附图说明图1为本专利技术的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1在发酵培养基中转化植物甾醇的过程研究。图2为本专利技术的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1在添加吐温80的发酵体系与常规发酵体系下,转化植物甾醇生成9α-OH-AD含量的比较。具体实施方式实施例1分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1的分离鉴定以及菌株的保存(1)分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1的分离、筛选本专利技术从国内合成甾体化合物的化工厂厂房周围取得土样,称取1.0-2.0g土样于250mL三角瓶中,用10-50mL生理盐水悬浮,然后置于水浴锅中,60℃处理10min,冷却后进行梯度稀释,取0.2mL稀释液涂布于植物甾醇为唯一碳源的固体平板上进行初筛。30℃条件下培养120h后,选取长势较好的单菌落进行发酵验证。挑取单菌落接种到新鲜的液体种子培养基,30℃、90-150r/min培养72h,再以1%(w/w)的接种量接入装液量为100mL/500mL的发酵培养基,相同培养条件下120h,收集转化液,经乙酸乙酯抽提和0.22μm的有机膜处理后,采用高效液相色谱检测底物植物甾醇的转化率和产物9α-OH-AD的得率。(2)分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1的鉴定16srDNA菌种鉴定:通过基因组试剂盒提取分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1菌株的全基因组,采用通用引物27F和1492R调取该菌株的16srDNA片段,测序结果于NCBI上进行比对。(3)菌株保存:挑取一环分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1菌株接种于种子液体培养基中,20-35℃,120r/min振荡培养60-72h后,取0.5mL的细胞培养液转入装有0.5mL的60%甘油保藏管中,-20℃冷冻保藏。然后于2016年9月22日保藏至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.13031,分类命名为分枝杆菌Mycobacteriumsp.。实施例2利用分枝杆菌CGMCCNo.13031(Mycobacteriumsp.)LY-1转化植物甾醇(1)制备分枝杆菌CGMCCNo.13031(Mycobacteriumsp.)LY-1菌株的细胞液体培养物挑取固体PDA培养基上的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1菌株一环,接种在装有100mL种子培养基的500mL锥形瓶中,在30℃下,置于摇床上以120r/min的转速培养6本文档来自技高网
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【技术保护点】
一株高效转化植物甾醇的菌株,该菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)LY‑1,该菌于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.13031,分类命名为分枝杆菌Mycobacterium sp.。

【技术特征摘要】
1.一株高效转化植物甾醇的菌株,该菌株为分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1,该菌于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.13031,分类命名为分枝杆菌Mycobacteriumsp.。2.利用分枝杆菌CGMCCNo.13031转化植物甾醇为9α-羟基雄甾-4-烯...

【专利技术属性】
技术研发人员:宋宇迪许正宏史劲松李会王萌慧董玉秀张晓娟
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

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