本发明专利技术涉及阿尔兹海默症关键致病因子app的基因工程细胞株及药物筛选模型。该细胞株通过如下步骤构建：(1)设计和构建可靶向识别app基因的Cas9质粒；(2)将构建好的靶向识别的Cas9质粒用脂质体方法转染进哺乳动物细胞；(3)利用Cas9特异敲除位点的基因组PCR产物和DNA序列测定以检测Cas9基因敲除的效率；(4)针对Cas9基因敲除高效的细胞，进行单克隆分离并逐一鉴定细胞敲除类型；(5)对敲除细胞株进行蛋白表达水平鉴定。本发明专利技术的app基因敲除细胞株可用于阿尔兹海默症的药物筛选；也可用于鉴定app基因在细胞中的相应功能，为后期阿尔兹海默症的诊断和药物筛选提供参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种阿尔兹海默症关键致病因子app的基因工程细胞株，该细胞株可用于阿尔兹海默症的诊断试剂盒开发和药物筛选。
技术介绍
阿尔兹海默症(Alzheimer’sDisease,AD)与肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿舞蹈症、帕金森症，并称为四大神经退行性疾病。AD病人在发病过程中逐渐丧失记忆及其它认知能力，由最初的记忆减退发展为重度痴呆，生活无法自理且死于并发症。该病进展缓慢，严重影响了患者的身心健康。AD疾病给患者、家庭及社会带来了巨大的精神和经济负担，目前世界上已经确诊的AD病例约为3600万，据推测，到2050年AD患者将为目前的3倍[1]。迄今为止，人们仍然不了解AD的发病机理，缺乏有效的诊断、治疗方法。神经元细胞外大量的β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)沉积是AD主要病理特征[2]，Aβ由前体APP经蛋白酶剪切形成[3]。通过对APP功能研究，从而为揭示AD疾病致病机制、针对APP开发有效的药物及治疗方法提供重要的线索。CRISPR/Cas技术是最近兴起的一项基因组编辑技术。CRISPR/Cas系统包含具有核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)基因和crRNA和tracrRNA这两种决定切割位点特异性的非编码RNA[4]。crRNA和tracrRNA相互碱基配对形成tracrRNA/crRNA复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。我们通过人工设计这两种RNA，改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，来实现Cas9蛋白对DNA的定点切割[5‐6]。目前尚未见相关报道利用CRISPR/Cas技术实现对阿尔兹海默症app基因的敲除，以获得体外培养的人类细胞app基因缺失的细胞株。参考文献[1]Wimo,A.,andPrince,M.(2010).WorldAlzheimerReport2010:TheGlobalEconomicImpactofDementia(London:Alzheimer’sDiseaseInternational),pp.1–56.[2]JohnHardy,DennisJ.Selkoe.TheAmyloidHypothesisofAlzheimer'sDisease:ProgressandProblemsontheRoadtoTherapeutics.Science2002；297:353-356[3]CliveBallard,SergeGauthier,AnneCorbett,CarolBrayne,DagAarsland,EmmaJones.Alzheimer’sdisease.Lancet2011；377:1019–31[4]CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,etal.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science2013；339(6121):819-23.[5]JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,HauerM,DoudnaJA,CharpentierE.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science2012；337(6096):816-21.[6]MaliP,YangL,EsveltKM,AachJ,GuellM,DiCarloJE,etal.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science2013；339(6121):823-6.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种阿尔兹海默症致病基因app的基因工程细胞株及药物筛选模型，可用于阿尔兹海默症的诊断试剂盒开发和药物筛选。进一步地，所述的质粒是指用于阿尔兹海默症致病基因app敲除的插入有如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示碱基序列的Cas9敲除质粒。进一步地，本专利技术基因工程细胞株是指app基因纯合缺失，杂合缺失的哺乳动物细胞。本专利技术应用Cas9技术敲除app基因，采用DNA-LipofectamineTM2000转染方法，实现了阿尔兹海默症app基因缺失细胞株的构建，可以应用在app基因在细胞中的相关功能及导致AD的分子机制的研究中。本专利技术是通过以下技术方案实现的，具体步骤如下：1、app基因敲除Cas9质粒的构建：2、稳定转染：用DNA-LipofectamineTM2000瞬时转染的方法将基因跨膜结构域编码区敲除的Cas9质粒转染进哺乳动物细胞，用抗生素进行筛选并用有限稀释法将细胞进行单克隆化。所述的哺乳动物细胞为HeLa、K562、HEK293、A549、MCF-7、LNCap、N2aSH-SY5Y或者其它哺乳动物细胞中的任一种。附图说明图1Cas9结合区域。图2Cas9质粒载体的图谱。图3Cas9蛋白表达质粒载体PX335结构示意图。图4直接测序检测Cas9表达载体对app基因的敲除的有效性。图5Cas9敲除后的APP蛋白表达检测。具体实施方式下面对本专利技术的实施例结合附图作详细说明。本实施例在以本专利技术技术方案为前提下实施，给出了具体实施方式和具体操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述实施例。凡依照本专利技术公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利技术的保护范围。主要试剂及检测试剂盒：HeLa细胞，Cas9敲除载体质粒PX335，购自addgene公司；转染试剂lipofectin2000购自Invitrogen公司；DMEM、胎牛血清FBS购自Hyclone公司；APP抗体购于Sangon，二抗Anti-RabbitIgG为美国GE公司产品；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂。实施例中，酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。实施例1app基因的敲除一、Cas9技术敲除HeLa细胞app基因本实施方式根据app基因的外显子序列设计并构建Cas9载体，如图1，选择的Cas9序列SEQIDNO.1对应app基因的第2号外显子上。下划线的部分为Cas9的识别部位，小写部分是Cas9中的Cas9蛋白的切割位点。在选定Cas9以后对全基因组进行查重，确认本Cas9位点是唯一的，保证了基因敲除的可控性并降低了基因敲除脱靶率。CCCACTGATGGTAATGCTGGCCTgctggctgaaCCCCAGATTGCCATGTTCTGTGGSEQIDNO.1PX335质粒是一种Cas9蛋白表达载体，如图2所示。限制性内切酶BbsI酶切后会产生粘性末端GTGG和粘性末端GTTT。借助这一特性，我们设计产生sgRNA的引物两条链后面分别加上了CACC和CAAA，与BbsI消化后的PX335质粒产生的粘性末端碱基互补，如图3所示。具体为：二、app基因Cas9敲除质粒的构建将设计好的引物委托生物技术公司合成。引物合成后SEQIDNO.2和SEQIDNO.3退火反应，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5退火反应，使其分别成为带有粘性末端的双链DNA片段。退火程序如下：95℃，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种阿尔兹海默症的基因工程细胞株，其特征在于：是指致病基因app完全或者部分缺失的哺乳动物细胞。
【技术特征摘要】
1.一种阿尔兹海默症的基因工程细胞株，其特征在于：是指致病基因app完全或者部分缺失的哺乳动物细胞。2.一种用于app基因编码序列敲除的Cas9质粒载体，其特征在于：是指分别插入有如SEQIDNO.2和SEQIDNO.4所示碱基序列的质粒。3.根据权利要求2所述的用于app基因编码序列敲除的Cas9质粒载体，其特征在于：所述的质粒是指PX335。4.一种基于权利要求2或3所述的Cas9质粒载体的app基因编码序列敲除方法，其特征在于，包括如下步骤：将上述质粒载体转染哺乳动物细胞中，对app基因编码序列进行PCR扩增，再对扩增产物测序检测app基因编码序列发生敲除的细胞。5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈实，王雅洁，杨欢，
申请(专利权)人：武汉荣实医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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