一种用于筛选高产番茄红素的三孢布拉霉菌培养基制造技术

本发明专利技术提供了一种用于筛选高产番茄红素的三孢布拉霉菌培养基，包含葡糖糖、土豆、琼脂、水，其特征是添加去氧胆酸钠，葡糖糖、土豆、去氧胆酸钠、琼脂、水的质量百分比为：葡糖糖2.0～2.5%，土豆20～25%，去氧胆酸钠0.05%～0.06%，琼脂2.0～2.5%，其余为水。本发明专利技术加入了去氧胆酸钠后，有效地防止了霉菌菌丝蔓延，抑制革兰氏阳性菌的生长，在培养筛种过程中有助于得到独立的单菌落，筛选出有高产的三孢布拉霉菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于真菌培养
，具体涉及一种三孢布拉霉菌的筛选培养基。
技术介绍
番茄红素是植物中所含的一种天然色素，主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。是许多类胡萝卜素生物合成的中间体。其抗氧化性能在所有类胡萝卜素中是最强的，它清除单线态氧的能力是常用抗氧化剂维生素E的100倍，是β-胡萝卜素的2倍以上；番茄红素具有优越的生理功能，它不仅具有抗癌抑癌的功效，而且对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统以及延缓衰老等都具有重要意义，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。三孢布拉霉Blakesleatrispora是笄霉菌科（Choanephoraceae），毛霉菌目（Mucorales），接合菌门（Zygomycota），真菌界（Fungi），是雌雄异株，有正负菌之分。经研究发现，将三孢布拉霉正菌、负菌单独培养时，能产生无性孢子和少量的类胡萝卜素，而将正负菌混合培养时能大大提高类胡萝卜素的产量。利用三孢布拉霉菌生产的番茄红素已经在国际市场作为一种新型的食品添加剂使用。但现有的培养基培养在筛选三孢布拉霉高产菌株时，呈蔓延生长状态，生产过于旺盛，难以将单个孢子形成的菌落分隔开，给挑选单菌落的菌株带来困难，难获取高产番茄红素的三孢布拉霉菌株，导致发酵生产过程番茄红素低。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目标是针对上述不足，提供一种得到独立的单菌落，快速、准确的筛选出三孢布拉霉高产菌株的培养基。本专利技术的是这样实现的：一种高产番茄红素的三孢布拉霉菌的筛选培养基，包含葡糖糖、土豆、琼脂、水，其特征是添加去氧胆酸钠，葡糖糖、土豆、去氧胆酸钠、琼脂、水的质量百分比为：葡糖糖2.0～2.5%，土豆20～25%，去氧胆酸钠0.05%～0.06%，琼脂2.0～2.5%，其余为水。本专利技术加入了去氧胆酸钠后，有效地防止了霉菌菌丝蔓延，抑制革兰氏阳性菌的生长，在培养筛种过程中有助于得到独立的单菌落，筛选出有高产的三孢布拉霉菌。实验1以配制500ml的培养基为例：按比例大致取土豆，去皮切块（约3cm×3cm×1cm），再准确称量200g，沸煮30分钟，过滤，加入准确量取的葡糖糖10g、去氧胆酸钠0.25g，琼脂4g，充分混匀，加水定容，装瓶，封口，高温121℃灭菌20-30分钟。取出降温至徒手可承受的温度，将其倒入已灭菌平板，静置，冷却。接种2ml孢子浓度为10-5的三孢布拉霉菌接种液。共计接种平板10皿，接种后在27℃培养7天。每天观察，记录菌落初出时间、单菌落数量、菌落直径、菌落颜色，并统计所有平板内细菌的污染数量（细菌菌落数量）。具体结果如下：表1：天数单菌落数(个)菌落平均直径（mm）菌丝状态菌落颜色细菌菌落数（个）10//020//03233.5±0.45白色04696±0.4白色，略显浅黄05757±0.2菌丝均匀，菌丝浅黄，有少数黑色孢子出现06799±0.33菌丝均匀，菌丝浅黄，黑色孢子增多078211±0.2菌丝均匀，菌丝浅黄，黑色孢子较多0实验2以配制500ml的培养基为例：按比例大致取土豆，去皮切块（约3cm×3cm×1cm），再准确称量200g，沸煮30分钟，过滤，加入准确量取的葡糖糖10g，琼脂4g，充分混匀，加水定容，装瓶，封口，高温121℃灭菌20-30分钟。取出降温至徒手可承受的温度，将其倒入已灭菌平板，静置，冷却。接种2ml孢子浓度为10-5的三孢布拉霉菌接种液。共计接种平板10皿，接种后在27℃培养7天。每天观察，记录菌落初出时间、单菌落数量、菌落直径、菌落颜色，并统计所有平板内细菌的污染数量（细菌菌落数量）。具体结果如下：表2：实验3以配制500ml的培养基为例：按比例大致取土豆，去皮切块（约3cm×3cm×1cm），再准确称量200g，沸煮30分钟，过滤，加入准确量取的葡糖糖10g、去氧胆酸钠0.1g，琼脂4g，充分混匀，加水定容，装瓶，封口，高温121℃灭菌20-30分钟取出降温至徒手可承受的温度，将其倒入已灭菌平板，静置，冷却。接种2ml孢子浓度为10-5的三孢布拉霉菌接种液。共计接种平板10皿，接种后在27℃培养7天。每天观察，记录菌落初出时间、单菌落数量、菌落直径、菌落颜色，并统计所有平板内细菌的污染数量（细菌菌落数量）。具体结果如下：表3比较实验1和2，实验2中不加去氧胆酸钠，结果显示：三孢布拉霉菌菌丝较容易蔓延，单菌落在5天时连成整体，不利于选种过程中单菌落的挑选，由此可能会影响筛选得到最优菌株的结果，继而影响后续生物发酵生产番茄红素的产量。另外，不加去氧胆酸钠，平板被污染的概率较高。比较实验3和实验1、2，实验3中氧胆酸钠仅加0.1g，结果显示：三孢布拉霉菌菌丝蔓延程度较实验2高，较实验1低，单菌落在7天时连成整体，影响筛选最优菌株。另外，平板被污染的概率也介于二者之间。综合以上实验表明，使用本专利技术的培养基可得到独立的单菌落，快速、准确的筛选出三孢布拉霉高产菌株，通过本专利技术的培养基筛选出的三孢布拉霉菌生长速度快，生长繁殖量高，发酵生产所得番茄红素产量高。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步说明。1、培养基的制备：以配制500ml的培养基为例：按比例大致取土豆，去皮切块（约3cm×3cm×1cm），再准确称量200g，沸煮30分钟，过滤，加入准确量取的葡糖糖10g、去氧胆酸钠0.25g，琼脂4g，充分混匀，加水定容，装瓶，封口，高温121℃灭菌20-30分钟。取出降温至徒手可承受的温度，将其倒入已灭菌平板，静置，冷却。2、斜面培养：挑一环斜面中的菌丝到装有已灭菌生理盐水和小玻璃珠的三角瓶中，振荡混匀，稀释至10-3-10-7，涂平板，在27-28℃，相对湿度50%左右培养。待有菌落出现，挑选单菌落移接到斜面上（每个菌落接2支斜面），培养4-5天。正菌成熟斜面特征：菌丝浅黄色，菌丝比负株略粗，孢子较多且黑；负菌成熟斜面特征：菌丝浅黄色，菌丝状态均匀，孢子较少。其中正负菌株各20支斜面甘油保存于超低温冰箱，另外相同顺序编号的正负菌株各20支斜面则进行摇瓶试验。3、平板培养：取用甘油保存的菌种，20ml无菌水洗下孢子，取0.1ml涂平板，在27-28℃，相对湿度50%左右，培养5-7天。正负菌株分别进行操作，切不可将二者混淆。正菌成熟平板特征：菌丝浅黄色，菌丝比负株略粗，菌落直径10-12mm，4天出孢，6-7天孢子长齐，孢子较多且为黑色；负菌成熟平板特征：菌丝鲜黄色，菌丝状态均匀，菌落直径10mm，比正株略小，产色素。注意：正负菌株分别进行操作，切不可将二者混淆。4、初筛：如A，B中所述，挑出并保存的菌，每株两瓶分两批进行初筛。正负株随机结合，按1:5~7比例接入发酵摇瓶，发酵周期5天。放瓶后，测定番茄红素含量。从中选出单位较高的5株正菌和5株负菌。5、复筛：经初筛选出的5株正菌和5株负菌，按初筛的结合顺序，继续进行摇瓶复筛试验。发酵周期5天，以生产菌作为对照，共进行3次对比实验。并选出产单位最高的2株正菌和2株负菌，扩大培养，保存，备用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选高产番茄红素的三孢布拉霉菌培养基，包含葡糖糖、土豆、琼脂、水，其特征是添加去氧胆酸钠，葡糖糖、土豆、去氧胆酸钠、琼脂、水的质量百分比为：葡糖糖2.0～2.5%，土豆20～25%，去氧胆酸钠0.05%～0.06%，琼脂2.0～2.5%，其余为水。

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选高产番茄红素的三孢布拉霉菌培养基，包含葡糖糖、土豆、琼脂、水，其特征是添加去氧胆酸钠，葡糖糖、土豆、去氧胆酸钠、琼...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钱钢，杨宗禄，张小元，张燕，唐金祥，和银权，
申请(专利权)人：丽江映华生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53