一种测定二肽基肽酶IV活性的荧光探针底物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种二肽基肽酶IV的特异性荧光探针底物及其应用，属生物医药技术领域。该探针底物为萘酰亚胺的C-4酰胺衍生物GPAN，其可用于测定不同生物体系中DPP-IV的酶活。DPP-IV酶活测定的流程如下：选择GPAN酰胺水解反应为探针反应，通过定量检测单位时间内GPAN脱二肽基代谢产物的生成量来测定各类生物样品中DPP-IV的活性。本发明专利技术可用于不同种属、不同个体来源生物样本中DPP-IV酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中DPP-IV酶活的定量测定，以期实现对人体重要代谢酶DPP-IV活性的定量评估。此外，借助该探针反应还可用于快速筛选DPP-IV的抑制剂或诱导剂，并评估其抑制或诱导能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种测定二肽基肽酶IV的特异性荧光探针底物及其应用。
技术介绍
二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV,EC 3.4.14.5)是以二聚体形式存在的跨膜丝氨酸蛋白酶，广泛分布于哺乳动物的肾、肝、胃肠、胰腺上皮细胞及血管内皮细胞，也能以溶解形式存在于血浆和脑脊液中。DPP-IV能特异性地催化多肽链N末端第2位的氨基酸残基脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)肽键水解断裂，即水解掉两个氨基酸残基Xa-Pro和Xa-Ala(Xa为除脯氨酸外的任何氨基酸)，从而参与体内多种生物活性多肽的激活，以及使体内多种活性多肽部分或完全失活，如肠促胰岛素(incretin)、神经肽Y(neuropeptide Y)、胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)、生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)等。基于肠促胰岛素的新型DPP-IV抑制剂可以提高体内胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)的浓度、延长其作用时间，改善α-及β-细胞功能障碍，同时还具有增加胰岛素敏感性的作用，并且具有低血糖发生率低，不影响胃排空等特点。因此，DPP-IV已经成为了治疗2型糖尿病新的靶点。有研究推测DPP-IV抑制剂可能是通过抑制泡沫细胞生成进而可以抑制动脉粥样硬化发展，也可通过抑制基质细胞衍生因子(SDF1-1α)和基质P的退化来保证胰岛素浓度提供潜在的心脏保护功能(Diabetologia,2012,55,2267-2275)。除此之外，DPP-IV在黑色素瘤、肺癌、前列腺癌中低表达，在口腔癌和直肠癌
血清中低表达，随着子宫内膜恶性腺瘤的恶化DPP-IV的表达量逐渐降低；然而，研究发现在原发性肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、食道恶性腺瘤中却呈现出相反的结果(Biotecnología Aplicada 2014,31,102-110)。因此，开发灵敏度高、特异性强的DPP-IV探针底物，不仅可以更好地探究DPP-IV在相关疾病中的所发挥的重要作用，还可以为DPP-IV靶向药物的筛选及定量测定生物体系内DPP-IV的活性提供有力的技术支撑。目前，测量DPP-IV活性的方法主要包括对硝基苯胺衍生物底物显色法和4-甲基-7-氨基香豆素衍生物荧光探针法。已知的荧光底物均属于off-on型探针，单酶选择性并不高且易受生物基质的干扰，定量误差较大，应用时(如DPP-IV抑制剂的筛选)容易得到假阳性或假阴性的结果。而比率型探针发射光谱的蓝移/红移则可用于比率检测，通过荧光比率法进行酶活检测，由于基于酶底物和产物两个不同波长处的荧光强度，以其比值作为信号参量，此时探针分子原型可作为内部校准来减小光照强度、探针浓度、样品不均匀、仪器参数等对定量分析的影响，与传统的荧光探针相比，此种比率型荧光探针具有更好的选择性、灵敏度和动态响应范围。因此，开发高选择性的DPP-IV比率型荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特异性荧光探针底物及其应用，该比率型荧光探针底物和去二肽基化产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物的荧光量子产率更高更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中DPP-IV的分布和功能进行定量评价。本专利技术提供了一种二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特异性荧光探针底物，该探
针底物可被DPP-IV特异性催化生成具有不同荧光属性的产物并生成相应的4-氨基萘酰亚胺，该底物结构式如下：其中，R选自C2-C10烷基、-(C1-C8亚烷基)-羧基、-(C1-C8亚烷基)-酯基、-(C1-C8亚烷基)-氨基、-(C1-C8亚烷基)-氰基、-(C1-C8亚烷基)-硝基、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、碳环基、-(C1-C3亚烷基)-碳环基、芳基、-(C1-C3亚烷基)-芳基、杂芳基、-(C1-C3亚烷基)-杂芳基、杂环基或-(C1-C3亚烷基)-杂环基。本专利技术还提供一种测定二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特异性荧光探针底物的应用，采用该二肽基肽酶IV(DPP-IV)特异性底物，与含二肽基肽酶IV(DPP-IV)的生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其去二肽基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中DPP-IV的活性，具体测定方法及条件如下：A.体系中以GPAN作为比率型探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；B.在PBS缓冲液中，反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；C.反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的N-去二肽基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；D.测定单位时间内底物减少量或N-去二肽基化产物生成量作为DPP-IV活性的评价指标。具体测定方法及条件中，单点测定时底物浓度优选Km。具体测定方法及条件中，反应温度优选37℃，孵育体系pH优选pH7.4。所述的生物体系为重组表达DPP-IV单酶、人或动物组织制备液或各类哺乳动物组织细胞及其制备物中的任意一种。该探针底物及其去二肽基化产物的荧光信号需采用不同检测波长去检测，去二肽基化产物及底物的荧光检测条件分别为：激发波长430，360nm，最大发射波长分别为535，455nm。该探针底物还可用于DPP-IV抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。该探针底物也可作为实验动物在体及整体DPP-IV的探针底物，评估代谢酶DPP-IV的个体及种属差异。本专利技术提供的DPP-IV的比率型荧光探针反应的应用，该探针底物及其N-去二肽基化产物均具有荧光属性，且两者具有不同的光学属性，可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；N-去二肽基化产物及底物荧光检测条件分别为：激发波长430，360nm，最大发射波长分别为535，455nm。该特异性探针底物为比率型荧光探针，其在DPP-IV活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组DPP-IV、人及动物组织制备液及各类组织细胞中DPP-IV酶活的定量测定；同时也可作为在体及动物整体DPP-IV的探针底物，评估代谢酶DPP-IV的个体及种属差异。该探针底物及N-去二肽基化代谢产物的荧光检测方法还可用于DPP-IV抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。作为高特异性的DPP-IV单酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测DPP-IV的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的DPP-IV的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中DPP-IV的活性标定。选用本专利技术所述DPP-IV单酶的比率型荧光探针反应检测DPP-IV单酶体外
活性具有以下突出优势：(1)高特异性：GPAN可被DPP-IV高特异性地代谢成一个代谢产物，即N-去二肽化产物。(2)廉价易得：GPAN可经化学合成获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定二肽基肽酶IV的特异性荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被DPP‑IV特异性催化发生肽键水解反应并生成相应的4‑氨基萘酰亚胺,该探针底物的结构如下：其中，R选自C2‑C10烷基、‑(C1‑C8亚烷基)‑羧基、‑(C1‑C8亚烷基)‑酯基、‑(C1‑C8亚烷基)‑氨基、‑(C1‑C8亚烷基)‑氰基、‑(C1‑C8亚烷基)‑硝基、‑(C1‑C3亚烷基)‑O‑(C1‑C3烷基)、碳环基、‑(C1‑C3亚烷基)‑碳环基、芳基、‑(C1‑C3亚烷基)‑芳基、杂芳基、‑(C1‑C3亚烷基)‑杂芳基、杂环基或‑(C1‑C3亚烷基)‑杂环基。

【技术特征摘要】
2015.05.14 CN 20151024583051.一种测定二肽基肽酶IV的特异性荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被DPP-IV特异性催化发生肽键水解反应并生成相应的4-氨基萘酰亚胺,该探针底物的结构如下：其中，R选自C2-C10烷基、-(C1-C8亚烷基)-羧基、-(C1-C8亚烷基)-酯基、-(C1-C8亚烷基)-氨基、-(C1-C8亚烷基)-氰基、-(C1-C8亚烷基)-硝基、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、碳环基、-(C1-C3亚烷基)-碳环基、芳基、-(C1-C3亚烷基)-芳基、杂芳基、-(C1-C3亚烷基)-杂芳基、杂环基或-(C1-C3亚烷基)-杂环基。2.一种如权利要求1所述测定二肽基肽酶IV的特异性荧光探针底物的应用，其特征在于：采用该二肽基肽酶IV的特异性底物，与含二肽基肽酶IV的生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其去二肽基产物的生成率来定量测定不同生物体系中DPP-IV的活性，具体测定方法及条件如下：A.磷酸盐缓冲体系中加入探针底物GPAN；底物浓度为1/10～10Km；B.反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；C.反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的N-去二肽基化产物达到定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，邹立伟，葛广波，钱星凯，冯磊，王平，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21