一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于卟啉和核酸复合纳米结构的电致化学发光用于DNA探针与电极表面相互作用的分析方法。本发明专利技术通过序列设计，利用DNA碱基互补配对的特性，自组装形成特定的纳米结构，并在纳米结构的基础上，将锌卟啉通过G‑四链体的方式与DNA探针进行等摩尔的组装，利用锌卟啉能够发生电致化学发光的特性作为信号源，实现对不同DNA探针的信号强度的检测，并通过分析信号强度对DNA探针的设计进行进一步优化。本发明专利技术通过ECL的检测方式，能够直观地表征DNA探针界面与信号强度的关系，更加贴近实际检测体系，能够应用于DNA探针的设计和验证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法。
技术介绍
在电化学DNA传感器的设计中，DNA探针的设计是关键。DNA在电极表面的固定方式直接决定DNA在电极表面的组装密度和探针DNA的空间姿态，也直接影响DNA传感器的灵敏度和使用寿命。具体的DNA探针对于信号强度的影响仍然不明确，通常通过最终的检测结果来验证探针设计是否可行，然而并不能确定信号强度不佳是否是由于DNA界面导致的(Mascini,et al.,DNA electrochemical biosensors.Fresenius'journal of analytical chemistry,2001.369(1):15-22.)。在DNA探针设计中，一维的DNA探针，末端基团固定不牢靠，易脱落，一维探针在电极表面有一定倾角，在一锥形区域内摆动，不利于高密度的组装。二维探针较一维探针固定更加牢靠，姿态更加优良。三维立体DNA探针，有更好的稳定性和特异性，探针姿态良好，自由度大，易于目标分子的特异性结合(Pei,H.,et al.,A DNA Nanostructure-based Biomolecular Probe Carrier Platform for Electrochemical Biosensing.Advanced Materials,2010.22(42):4754-4758.)。电致化学发光分析兼有电化学分析和光学分析的特点，具有普通光学分析法难以比拟的分析性能。比如，电致化学发光无需激发光源，不存在类似于荧光分析法的发散光背景干扰的问题。此外，电致化学发光物质和共反应剂之间的特异性可以减少电致化学发光反应的副反应，以及无明显高浓度自猝灭的发生。G-四链体结构是一种卟啉嵌入到一段富含GT的折叠单链DNA序列形成的超纳米结构，可以折叠包裹卟啉分子形成稳定的纳米结构，克服了卟啉分子水溶性不佳的问题(Zhao C,Wu L,Ren J,et al.A label-free fluorescent turn-on enzymatic amplification assay for DNA detection using ligand-responsive G-quadruplex formation[J].Chemical Communications,2011,47(19):5461-5463.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，利用DNA纳米结构的空间组合，对DNA传感器中DNA探针与电极表面的相互作用进行分析，验证设计探针的可行性，有利于进一步优化构建核酸传感器。实现本专利技术目的的技术解决方案为：一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，利用DNA探针与卟啉的相互作用结合信号分子，利用卟啉的光电特性，以电致化学发光作为检测手段，具体步骤如下：步骤1，将待测DNA探针溶液滴加到电极表面，过夜后，去离子水去除未结合的DNA，然后将电极置于含有锌卟啉(ZnPPIX)的缓冲溶液中进行G-四链体的自组装，去离子水去除未反应的卟啉分子，氮气吹干；步骤2，以步骤1所得的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵的(TBAP)的二氯甲烷溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为-2.5～-0.2V，扫描速度为100mV S-1，检测ECL的信号强度。步骤1中，所述的缓冲溶液中，甲醇与HEPES缓冲液的体积比为1：4～9，HEPES缓冲液的pH为7.4，ZnPPIX的浓度为1～2mM。优选地，步骤1中，所述的待测DNA探针为每条单链的四面体序列有三分之一的序列和其他三条链互补配对的四条DNA单链经变性、退火自组装成的底端为四面体结构，顶端延伸出G-四链体序列的三维DNA探针。本专利技术构建了一种利用新的纳米结构分析DNA探针与电极表面相互作用的方法，通过ECL的检测方式，能够直观地表征DNA探针界面与信号强度的关系，更加贴近实际检测体系，此外，通过三维的探针设计可以达到比一维以及二维DNA传感器更大的检测信号。附图说明图1为实施例2中四面体组装过程中相应的电泳图。图2为实施例2中表面修饰不同DNA探针的电极表面的形貌AFM图。图3为实施例2中表面修饰不同DNA探针的电极的电化学阻抗谱图。图4为实施例3中锌卟啉与DNA构建的纳米结构的SPR图。图5为实施例3中G-四链体的紫外吸收图。图6为实施例3中卟啉DNA纳米结构的圆二色光谱图。图7为实施例4中表面修饰不同DNA探针的电极的ECL检测结果图。具体实施方式为进一步详细说明本专利技术的
技术实现思路
，在具体实施例中，通过构建三种不同的DNA探针，即一维、二维和三维DNA探针，采用本专利技术方法对三种不同探针与电极表面相互作用进行分析，一维、二维和三维探针的构建如下：(1)根据所需要的空间结构，设计末端基团修饰，顶端含有G-四链体序列的DNA序列。(2)一维探针为末端直接标记巯基的DNA单链(g-1)。(3)二维探针前体为末端修饰氨基的DNA单链(g-2)，氨基与二硫化碳在硼酸缓冲液中震荡发生加成反应，最终形成末端含有双巯基的二维探针。(4)三维探针是由四条DNA单链(Tetra-A，Tetra-B，Tetra-C，Tetra-D)，每条单链的四面体序列有三分之一的序列和其他三条链互补配对，在含有Mg2+的缓冲液中通过在PCR仪的温度控制，变性，退火形成四面体结构，四面体的底面三个顶点处均修饰有巯基。各探针的序列如下表所示：实施例11、DNA纳米结构的自组装，其步骤如下：一维DNA探针即末端修饰巯基的DNA单链g-1，将2μL DNA单链g-1(100μM)溶于5μL的三氯乙基磷酸酯(TCEP)(30mM)，42μL的TM缓冲液(20mMTris，50mMMgCl2，pH8.0)，1μL 6-巯基-1己醇(MCH)(1mM)的混合溶液中。二维DNA探针的构建：2μL末端氨基修饰的DNA单链g-2(100μM)，2μL的CS2(100μM)，40μL硼酸缓冲液(pH＝9)混合，震荡1h。然后在溶液中加入5μL的TCEP(30mM)作为巯基保护剂和1μLMCH(1mM)作为封闭剂，得到双巯基末端的DNA二维探针。三维探针的构建：将Tetra-A、Tetra-B、Tetra-C、Tetra-D单链DNA各2μL(100μM)，和5μL的TCEP(30mM)，37μL的TM缓冲液混合(20MmM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)，将混合溶液置于PCR仪内95℃变性2min，然后4℃退火30秒。然后加入1μL MCH(1mM)作为封闭剂，DNA单链自组装形成底端为四面体结构，顶端延伸出G-四链体序列的三维DNA探针。2、金电极上的G-四链体结构形成金电极的抛光预处理：金电极浸泡于H4BNa溶液中促使金电极的表面的巯基还原，用Al2O3打磨金电极去处经表面吸附的杂质，在去离子水和乙醇中超声，去除表面打磨后吸附的杂质，去离子水洗净电极表面，氮气吹干电极。将三种探针3μL分别滴加到直径3mm的抛光预处理后的金电极表面过夜。用去离子水冲洗，高纯N2吹干。将ZnPPIX溶解于10mL甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，将待测DNA探针溶液滴加到电极表面，过夜后，去离子水去除未结合的DNA，然后将电极置于含有锌卟啉的缓冲溶液中进行G‑四链体的自组装，去离子水去除未反应的卟啉分子，氮气吹干；步骤2，以步骤1所得的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵的的二氯甲烷溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为‑2.5～‑0.2V，扫描速度为100mV S‑1，检测ECL的信号强度。

【技术特征摘要】
1.一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，将待测DNA探针溶液滴加到电极表面，过夜后，去离子水去除未结合的DNA，然后将电极置于含有锌卟啉的缓冲溶液中进行G-四链体的自组装，去离子水去除未反应的卟啉分子，氮气吹干；步骤2，以步骤1所得的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵的的二氯甲烷溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为-2.5～-0.2V，扫描速度...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓盛元，姚传广，宋宏鑫，郑晨昱，崔宏达，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32