一种桃炭疽病菌分子检测引物及检测方法技术

技术编号:14255715 阅读:86 留言:0更新日期:2016-12-22 18:10
本发明专利技术涉及一种桃炭疽病菌分子检测引物及其检测方法,属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物PCGF:5’‑TACCTAACCGTTGCTTCGGC‑3’,下游引物PCGR:5’‑CCCAGTGCGAGACGTTAGTT‑3’;采用上述引物经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳可在桃炭疽病菌纯DNA、带菌的桃叶片和桃果实中特异性地扩增出片段长度为420bp的特异性扩增产物。本发明专利技术检测引物特异性强、灵敏度高,检测方法实用性好,操作简便快捷;本发明专利技术能实现桃炭疽病的早期检测,还能有效区分桃树上相似的褐腐病,对桃炭疽病的早期预警和防控,防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种桃炭疽病菌分子检测引物及其检测方法,专用于桃炭疽病菌的快速分子检测,同时可实现田间桃炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定,属于农作物病害检测和生物

技术介绍
桃属于蔷薇科李属落叶果树,我国是世界桃的起源中心。桃子素有“寿桃”、“仙桃”的美称,因其肉质鲜美,又被成为“天下第一果”。桃肉含蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素B1、糖分等,是我国重要的水果之一。桃炭疽病(Peach anthracnose)是桃树[Prunus persica(L.)Batsch]栽培上一种重要的病害,主要为害桃树枝梢、嫩叶及幼果,可导致果实腐烂、早落。在幼果初期发病时,果面呈褐色水渍状斑,以后随果实膨大病斑也扩大,红褐色,呈圆形或椭圆形,并明显凹陷。果实近成熟时发病,果面病斑显著凹陷,呈明显的同心环,潮湿时同心环上会出现桔红色小粒点,病斑逐渐扩大,乃至整个果实。新梢被感染后,出现暗褐色略凹陷的椭圆形病斑。桃炭疽病病原菌无性世代为盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioidsPenz),属半知菌亚门。该病原菌主要在桃树病枯枝和僵果上越冬。翌年春,病组织上产生的孢子借风雨传播到枝条、叶片和果实上,引起初次侵染。该病为害时期长,影响整个生长期。桃炭疽病初发期是病害防治的最佳时期,而在其病害初发期与桃褐腐病症状相似,以症状为基础的病害常规诊断技术,需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤,耗时长、效率低、准确性差,难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行,难以满足桃炭疽病诊断的实际需要。因此,建立一种快速、灵敏的检测方法用于桃炭疽病的早期诊断,为病害的最佳防治时期提供技术支撑,同时防治病害的传播具有重要意义。近年来,分子生物学技术发展迅速,随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用,一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径,其中PCR(polymerase chain reaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列种内的保守性和科属种间可变性的特点,设计特异性引物进行PCR,对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用,国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法,实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关桃炭疽病菌分子检测的研究尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中对桃炭疽病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征,程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低,难以满足桃炭疽病诊断的实际需要问题,提供了一种桃炭疽病菌分子检测引物及其检测方法。为实现上述目的,本专利技术采取了以下技术方案:本专利技术首先提供了一种桃炭疽病菌分子检测引物,其核苷酸序列为:上游引物PCGF:5’-TACCTAACCGTTGCTTCGGC-3’;下游引物PCGR:5’-CCCAGTGCGAGACGTTAGTT-3’。所述引物PCGF和PCGR对桃炭疽病菌特异性扩增出420bp的产物。本专利技术还提供了一种桃炭疽病菌的快速检测方法,包括以下步骤:(1)从桃叶片或果实中提取DNA;用于检测病原菌纯培养物时,采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA;用于检测桃组织是否存在桃炭疽病菌时,采用NaOH 快速裂解法提取桃植株组织基因组DNA。(2) 以提取桃叶片或果实DNA为模板进行PCR扩增:PCR反应体系25μL,包含2.5μL 10×PCR buffer,2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture,0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶,10μmol/L的PCGF和PCGR各0.5μL,DNA模板1μL,加ddH2O至总体积达25μL;PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性40sec,55℃退火45sec,72℃延伸45sec,共35个循环;72℃延伸10min;(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析,电压为4-5V/cm;根据扩增产物的大小判定检测结果,如果能特异性扩增出420bp的产物,则可判定所述的桃叶片或果实中存在桃炭疽病菌,否则所述的桃叶片或果实中不存在桃炭疽病菌。本专利技术的积极有益效果在于:(1)准确性高:本专利技术是根据真菌核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对桃炭疽病菌具有特异扩增作用的PCR 引物。已经对不同地理来源的桃炭疽病菌、携带桃炭疽病菌的桃叶片、携带桃炭疽病菌的桃果实和健康的桃叶片和果实进行了检测验证,只有桃炭疽病菌和携带该病菌的叶片和果实中能特异性地扩增出一条420 bp 的电泳条带,说明本专利技术所设计的引物用于检测桃炭疽病菌准确可靠;(2)特异性强:本专利技术所设计的引物对桃炭疽病菌具有很强的特异性,能够用于区别桃炭疽病菌和桃褐腐病菌,从而能有效区分发生在桃上症状特征相似的病害;(3)灵敏度高:本专利技术将设计的特异引物与ITS 基因通用引物(ITS1/ITS4)联合起来进行巢式PCR 扩增后,对桃炭疽病菌的检测灵敏度在DNA 水平上可达到1fg;(4)适用性广、实用性好:本专利技术的桃炭疽病菌的检测方法,不仅能对病菌菌丝体进行检测,也能对感病的桃叶片和果实进行检测,可实现桃炭疽病菌的早期检测,即在病害显症前进行检测,防治病害的爆发流行。(5)操作简便快速:本专利技术只需进行DNA 提取、PCR 扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果,一般整个检测过程可在数小时内完成,操作简便快捷。附图说明图1为本专利技术引物对桃炭疽病菌特异性扩增电泳图:其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2、泳道3为桃炭疽病菌,泳道4-10分别为:桃褐腐病菌、大豆炭疽病菌、桃灰霉病菌、桃干腐病菌、桃白霉病菌、梨黑斑病菌、阴性对照。图2为本专利技术引物桃炭疽病菌的灵敏性检测扩增电泳图:图A:普通PCR灵敏度检测,其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2-12分别为:100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照; 图B为巢式PCR灵敏度检测,其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2-13分别为:100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、阴性对照、阳性对照。图3为本专利技术桃叶片和果实中桃炭疽病菌检测扩增电泳图,其中泳道M为2000bp DNA Marker,泳道2-10分别为自然发病的桃叶片、自然发病桃果实、人工接种发病的桃叶片、人工接种发病初期桃果实、健康桃叶片、健康桃果实、健康桃叶柄、阴性对照、阳性对照。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。实施例1 分子检测引物设计及桃炭本文档来自技高网
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一种<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201610888179.html" title="一种桃炭疽病菌分子检测引物及检测方法原文来自X技术">桃炭疽病菌分子检测引物及检测方法</a>

【技术保护点】
一种桃炭疽病菌分子检测引物,其特征在于:引物的核苷酸序列为:上游引物PCGF:5’‑TACCTAACCGTTGCTTCGGC‑3’下游引物PCGR:5’‑CCCAGTGCGAGACGTTAGTT‑3’。

【技术特征摘要】
1. 一种桃炭疽病菌分子检测引物,其特征在于:引物的核苷酸序列为:上游引物PCGF:5’-TACCTAACCGTTGCTTCGGC-3’下游引物PCGR:5’-CCCAGTGCGAGACGTTAGTT-3’。2.根据权利要求1所述桃炭疽病菌分子检测引物,其特征在于,所述上游引物PCGF和下游引物PCGR对桃炭疽病菌特异性扩增出420bp的产物。3.一种桃炭疽病菌的快速检测方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)提取桃叶片或桃果实的DNA;(2) 以提取的桃叶片或桃果实DNA为模板进行PCR扩增:PCR反应体系25μL,包含2.5μL 10×PCR buffer,2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNT...

【专利技术属性】
技术研发人员:杜宜新石妞妞阮宏椿甘林陈福如杨秀娟代玉立
申请(专利权)人:福建省农业科学院植物保护研究所
类型:发明
国别省市:福建;35

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