本发明专利技术公开了一种用于检测支原体的引物组，引物组包括：正向引物，其序列如SEQ ID No.1所示；以及反向引物，其序列如SEQ ID No.2所示；本发明专利技术还公开了采用该引物组的用于检测支原体的试剂盒，以及该试剂盒用于检测支原体污染的用途和检测方法。本发明专利技术的试剂盒操作简便、广谱性好、特异性强，且灵敏度高，能够快速检测支原体污染情况，应用前景很广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测支原体的引物组、试剂盒及检测支原体污染的方法，属于生物
技术介绍
支原体(Mycoplasma)污染是细胞培养过程中最常见的污染之一，特别是在哺乳动物细胞的培养过程中，支原体污染问题尤其令人头疼，主要原因有以下三点：1)支原体体积非常小，直径为0.1μm，一般过滤除菌无法去除，光学显微镜下难以看清它的形态结构；2)支原体生命力顽强，能在偏碱条件(pH 7.6～8.0)下生存，且对青霉素有抗药性；3)细胞受支原体污染初期，部分敏感细胞可见细胞生长增增殖变慢、形态变圆。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。支原体最终会导致细胞死亡，不过更常见的情况是，支原体与细胞共存。在这过程当中，支原体慢慢增殖，直至对细胞产生明显的影响，如干扰细胞迁移、信号转导、淋巴细胞活化和细胞因子表达。对于相关科研工作者来说，最可怕的是支原体污染在不知不觉中改变许多参数，使研究成果的可信度大打折扣。常用的支原体检测手段包括传统的培养法、ELISA法、PCR法等，目前PCR法是主流的支原体检测方法，然而目前已有的PCR支原体检测手段仍存在诸多问题，例如，广谱性不够、灵敏度不够或特异性不够等。
技术实现思路
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本专利技术一方面提供了一种用于检测支原体的引物组，其包括：正向引物，其序列如SEQ ID No.1所示；以及反向引物，其序列如SEQ ID No.2所示。本专利技术另一方面提供了一种用于检测支原体的试剂盒，其包括上述的用于检测支原体的引物组。优选的，所述试剂盒还包括：支原体裂解缓冲液，聚合酶链式反应试剂；以及阳性对照。更优选的，所述阳性对照包含支原体16S rDNA保守序列的阳性质粒。优选的，所述试剂盒还包括阴性对照。本专利技术再一方面提供了上述试剂盒用于检测支原体污染的用途。优选的，所述试剂盒用于检测以下支原体中的任意一种或几种：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma。本专利技术还一方面提供了一种采用上述的试剂盒检测支原体污染的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)支原体裂解：采用所述试剂盒中的支原体裂解缓冲液；处理待检测样品获得裂解液；步骤2)PCR扩增：将步骤1)所获得的裂解液与所述聚合酶链式反应试剂和所述引物组混合，进行PCR扩增反应；步骤3)电泳：将步骤2)所得的PCR扩增产物上电泳，根据电泳条带结果判断是否存在支原体污染。优选的，所述步骤2)的PCR扩增的条件如下：首先进行步骤a：94℃，10分钟；随后，步骤b：94℃，30秒；步骤c：60℃，30秒；步骤d：72℃，30秒；上述步骤b至步骤d共30个循环；最后进行步骤e：72℃，10分钟。优选的，所述步骤1)包括：对待检测的样品进行去除细胞碎片的处理，之后离心以沉淀支原体，该支原体沉淀物重新混悬于所述支原体裂解缓冲液中，并在90～95℃下加热3～5分钟。本专利技术的检测支原体的引物组，其试剂盒以及采用该试剂盒检测支原体污染的方法，具有以下优点：1)操作简便；2)判读容易：支原体检测的PCR反应产物单一，检测信息容易判断；3)广谱性好且特异性强：本专利技术特定的引物组专一地扩增支原体16S rDNA保守序列，不仅特异性强，并且能够能够适用于检测多种类型的支原体，广谱性好；4)灵敏度高；因此，本专利技术的试剂盒能够快速检测支原体污染情况，应用前景很广泛。附图说明图1为采用本专利技术实施例1的引物组扩增15种物种的体细胞DNA和支原体DNA阳性样品后的扩增产物的电泳结果；图2为采用本专利技术实施例1的引物组扩增14种支原体DNA样品后的扩增产物的电泳结果；图3为本专利技术实施例2的试剂盒的灵敏度试验的结果；图4为本专利技术实施例3中三个检测样品的电泳结果。具体实施方式在本专利技术的一个具体实施方案中，一种用于检测支原体的引物组，其包括正向引物和反向引物；正向引物的序列为5'-CGA GTC GGC ATC TAA TAC TAT-3'(参见序列表中的SEQ ID No.1)；反向引物的序列为5'-AAA ACG ACA TTT CTG CCG C-3'(参见序列表中的SEQ ID No.2)。在本专利技术的一个具体实施方案中，一种用于检测支原体的试剂盒，其采用上述的引物组。本专利技术的试剂盒是采用高灵敏度的PCR技术进行支原体检测。支原体的rDNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区，例如16S rDNA；虽然各种物种之间的碱基序列差别很大，但存在保守序列。专利技术人经过大量的研究试验，筛选出了可以特异性PCR扩增支原体的16S rDNA保守序列的引物组，不仅广谱性较好，且灵敏度较高。在本专利技术的一个具体实施方案中，试剂盒还包括：支原体裂解缓冲液；聚合酶链式反应试剂；以及阳性对照。其中，关于支原体裂解缓冲液，可以采用常规的支原体裂解缓冲液，诸如0.1mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.5％Triton X-100或Tween 20等；可以通过市场途径直接购买获得或自行配置后，装配入试剂盒。其中，关于聚合酶链式反应试剂，是PCR扩增反应所需的常规试剂，例如Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2和dNTPs等的组合；可以通过市场途径直接购买获得或自行配置后，装配入试剂盒。在本专利技术的一个具体实施方案中，PCR扩增反应的反应体系为：10倍的缓冲液5μl、dNTPs各200μmol/L、Taq酶2.5μl、待测样品5μl；总体积50μl(其余用灭菌双蒸水补平)。其中，关于阳性对照，在本专利技术的一个优选实施方案中，阳性对照可以包含支原体16S rDNA保守序列，更优选的，阳性对照可以为含有支原体16S rDNA保守序列的阳性质粒。当然，在本专利技术的一个替代实施方案中，可以采用现有的支原体检测试剂盒中的阳性对照，可市购、也可以根据现有技术自行构建。在本专利技术的一个优选实施方案中，试剂盒还可以包括阴性对照。阴性对照可以为不含有支原体DNA序列的溶液，例如无菌水、PCR缓冲液、生理盐水等。在本专利技术的一个具体实施方案中，上述试剂盒可以用于检测支原体污染。在本专利技术的一个优选实施方案中，上述试剂盒可以用于检测以下支原体中的任意一种或几种：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma。在本专利技术的一个具体实施方案中，一种采用上述的试剂盒检测支原体污染的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)支原体裂解：采用所述试剂盒中的支原体裂解缓冲液；处理待检测样品获得裂解液；步骤2)PCR扩增：将步骤1)所获得的裂解液与所述聚合酶链式反应试剂和所述引物组混合，进行PCR扩增反应；步骤3)电本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测支原体的引物组，其包括：正向引物，其序列如SEQ ID No.1所示；以及反向引物，其序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测支原体的引物组，其包括：正向引物，其序列如SEQ ID No.1所示；以及反向引物，其序列如SEQ ID No.2所示。2.一种用于检测支原体的试剂盒，其包括如权利要求1所述的用于检测支原体的引物组。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：支原体裂解缓冲液；聚合酶链式反应试剂；以及阳性对照。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为包含支原体16S rDNA保守序列的阳性质粒。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照。6.如权利要求2至4中任意一项所述的试剂盒用于检测支原体污染的用途。7.如权利要求6所述用途，其特征在于：所述试剂盒用于检测以下支原体中的任意一种或几种：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M....
【专利技术属性】
技术研发人员：张智培，熊延狮，
申请(专利权)人：上海逍鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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