一种多级连续发酵产L‑赖氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种多级连续发酵产L‑赖氨酸的方法。该方法以大肠杆菌出发通过四级以上发酵得产物L‑赖氨酸。具体是将至少四个发酵罐串连成一体，通过调节通气量、一级发酵罐的初糖浓度、各个发酵罐的碳源补料罐和氮源补料罐的添加速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率；控制各级发酵罐内的碳源浓度和氮源浓度；控制各级发酵罐中，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率在0.3‑0.8 h‑1来得到发酵产物。本发明专利技术方法使发酵体系中维持较高的菌体浓度，缩短细胞的延滞期，与分批发酵相比，底物利用率高，目标产物量大，产率稳定，不需要反复的洗罐、灭菌、接种等操作，降低生产成本。

A multistage continuous fermentation of L lysine

The invention discloses a multi-stage continuous fermentation of L lysine. The method of using Escherichia coli by more than four of fermentation products of L lysine. Concrete is at least four fermentation tank on integrated feeding tank by adjusting the ventilation volume, a fermentation initial sugar concentration, each fermenter tank feeding carbon source and nitrogen source addition rate, fermentation liquid outflow rate and fermentation liquid flow rate; control concentration of carbon source and nitrogen source concentration levels fermentation tank; control at all levels of the fermentation tank, that was all in the fermenter than in the growth rate of 0.3 0.8 H 1 to obtain fermentation products. The method of the invention is to maintain high cell concentration in the fermentation system, shorten the lag phase of cells, compared with batch fermentation, the substrate utilization rate is high, the product quantity, yield stability, do not need to repeatedly wash tank, sterilization, inoculation and other operations, reduce the production cost.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于L-赖氨酸制备领域，具体涉及一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法。
技术介绍
赖氨酸化学名称为2,6-二氨基己酸(2,6 -diaminohexanoicacid)，分子式NH2(CH2)4CH﹒(NH2)COOH,分子量146.19，是生物体必须的九种氨基酸之一，自然界存在的赖氨酸有L型和D型两种，而能够被人和动物所利用的为L-赖氨酸。 赖氨酸能调节体内代谢平衡，提高机体对谷类蛋白质的吸收，改善人类膳食营养和动物营养，促进生长发育；还能促进消化酶的分泌，促进胞内钙的运送，改善机体内氮的代谢平衡。赖氨酸是世界上除谷氨酸以外产量居第二位的商品氨基酸，可作为添加剂广泛应用在食品、药品和饲料等领域。 第二大氨基酸，2014年全球Ｌ-赖氨酸的产量为350万吨左右。随着Ｌ－赖氨酸的应用价值不断被发现和拓宽，其工业化生产的方法也不断地改善和更新。目前，L-赖氨酸的生产方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为Ｌ-赖氨酸生产应用最广的方法。目前，国内外在生产Ｌ-赖氨酸中采用的菌株主要为谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌、大肠杆菌和黄色短杆菌的改造型菌株，但是在发酵过程中常出现产物抑制、底物抑制，降低了产物的利用率，影响了产品的得率。多级连续高密度发酵是最近一种新的发酵方法，可以减少产物抑制和底物抑制对发酵结果的影响。
技术实现思路
针对现有工艺的不足，本专利技术的目的在于提供一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，该方法简化工艺的同时提高了L-赖氨酸的产量。一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，以大肠杆菌出发通过四级以上发酵得产物L-赖氨酸。上述多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：步骤1，配摇瓶培养基、种子培养基、初始发酵培养液、碳源补料罐培养液、氮源补料罐培养液和培养基补料罐培养液；步骤2，取碳源补料罐、培养基补料罐、氮源补料罐、四个以上发酵罐、摇瓶培养基、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、氮源补料培养液、培养基补料罐培养液以及三角烧瓶在高压灭菌10-15min，备用；步骤3，取灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的摇瓶培养基，接入出发菌株摇床37℃下200rpm培养6-10小时后作为发酵菌种；步骤4，将灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气或纯O2，再按照接种量体积比为5-10%接入发酵菌种，然后多级连续发酵系统开始运行，发酵80-100小时后得发酵产物，其中，初始发酵培养基从一级发酵罐中培养基流入二级发酵罐、三级发酵罐，依次流入到最后一级发酵罐中，通过调节通气量、一级发酵罐的初糖浓度、各级发酵罐的碳源补料罐和氮源补料罐的添加速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率；控制各级发酵罐内的碳源浓度和氮源浓度；控制各级发酵罐中，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率在0.3-0.8 h-1，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为32-38℃。作为优选的是，所述四级以上的发酵是指将6-10个发酵罐串连后发酵。作为优选的是，步骤1中碳源补料罐培养液为葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液或糖蜜中的一种。作为优选的是，步骤4通气量为0.03-0.08L/（min·L），一级发酵罐初糖浓度为20-90g/L，培养基补料罐流加速率为10-40ml/h，发酵液流出速率为50-170ml/h，通过控制发酵液流入速率为10 - 150 ml/h，细胞回流速率10-50ml/h，碳源补料罐培养液的添加速率为10-30ml/h，氮源补料速率控制为20-40ml/h。作为优选的是，当发酵罐数量为4个时，该四级发酵罐内糖浓度为：一级：90%-85%残糖；二级；70%-55%；三级：40%-25%；四级：15%-0%残糖；当发酵罐数量为5个时，该五级发酵罐内糖浓度为：一级：90%-80%残糖；二级；70%-60%；三级：50%-40%；四级：30%-20%残糖；五级：10%-0%残糖；当发酵罐个数为6个时，该六级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级；80%-70%；三级：70%-60%；四级：50%-40%残糖；五级：30%-20%残糖；六级：15%-0%残糖；当发酵罐数量为7个时，该七级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级；80%-70%；三级：70%-60%；四级：60%-45%残糖；五级：45%-35%残糖；六级：35%-15%残糖；七级：15%-0%残糖。作为优选的是，步骤4中用体积比为50%的氨水调节pH为6.5-7.5。有益效果本专利技术方法使发酵体系中维持较高的菌体浓度，缩短细胞的延滞期，与分批发酵相比，底物利用率高，目标产物量大，产率稳定，不需要反复的洗罐、灭菌、接种等操作，降低生产成本。附图说明图1为L-赖氨酸标准品高效液相色谱图；图2为实例1发酵产物的高效液相色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。本说明所说的多级连续发酵是根据串联发酵罐的个数来定，如串联为四个发酵罐即为四级连续发酵，其中第一个发酵罐为一级发酵罐，第二个发酵罐为二级发酵罐，第三个发酵罐为三级发酵罐，第四个发酵罐为四级发酵罐。实施例1一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：步骤1，配摇瓶培养基、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、氮源补料罐培养液和培养基补料罐培养液，配方如下：摇瓶培养基:蔗糖8g/L（分消），硫酸铵2g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4.3H20 2g/L，味精2g/L，丙酮酸0.5g/L，MgSO4 0.4g/L，FeSO4.7H20 0.01g/L，L-苏氨酸0.2g/L，生物素5mg/L。PH6.8-7.0。种子培养基：蔗糖25g/L（分消），酵母膏5g/L，硫酸铵10g/L，K2HPO4.3H20 1g/L，味精2.5g/L，丙酮酸0.5g/L，MgSO4 0.4g/L，FeSO4.7H20 0.01g/L，L-苏氨酸0.2g/L，生物素2.5mg/L，烟酰胺1.5mg/L，硫胺素0.45mg/L，pH6.8-7.0。初始发酵培养基：葡萄糖40 g/L（分消），硫酸铵20 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁1.5 g/L，硫酸亚铁0.015 g/L，硫酸锰0.015 g/L，硫酸铜0.077g/L，L-苏氨酸0.2g/L生物素0.8 mg/L，烟酰胺5mg/L，硫胺素35 mg/L，pH6.8-7.0。碳源补料罐培养液（g/L-1）：葡萄糖800。氮源补料罐培养液（g/L-1）：硫酸铵400。培养基补料罐培养液：磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁1.5 g/L，硫酸亚铁0.015 g/L，硫酸锰0.015 g/L，硫酸铜0.077g/L，L-苏氨酸0.2g/L生物素0.8 mg/L，烟酰胺5mg/L，硫胺素35 mg/L。步骤2，取碳源补料罐、培养基补料罐、氮源补料罐、四个1L发酵罐、摇瓶培养基、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多级连续发酵产L‑赖氨酸的方法，其特征在于，以大肠杆菌出发通过四级以上发酵得产物L‑赖氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，其特征在于，以大肠杆菌出发通过四级以上发酵得产物L-赖氨酸。2.根据权利要求1所述的多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：步骤1，配摇瓶培养基、种子培养基、初始发酵培养液、碳源补料罐培养液、氮源补料罐培养液和培养基补料罐培养液；步骤2，取碳源补料罐、培养基补料罐、氮源补料罐、四个以上发酵罐、摇瓶培养基、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、氮源补料培养液、培养基补料罐培养液以及三角烧瓶在高压灭菌10-15min，备用；步骤3，取灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的摇瓶培养基，接入出发菌株摇床37℃下200rpm培养6-10小时后作为发酵菌种；步骤4，将灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气或纯O2，再按照接种量体积比为5-10%接入发酵菌种，然后多级连续发酵系统开始运行，发酵80-100小时后得发酵产物，其中，初始发酵培养基从一级发酵罐中培养基流入二级发酵罐、三级发酵罐，依次流入到最后一级发酵罐中，通过调节通气量、一级发酵罐的初糖浓度、各级发酵罐的碳源补料罐和氮源补料罐的添加速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率；控制各级发酵罐内的碳源浓度和氮源浓度；控制各级发酵罐中，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率在0.3-0.8 h-1，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为32-38℃。3.根据权利要求2所述的一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述四级以上的发酵是指将6-10个发酵罐串连后发酵。4.根据权利要求2所述的一种多级连续发酵产L-赖氨酸的方法，其特征在于，步骤1中碳源补料罐培养液为葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，齐雁斌，张阿磊，陈西，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32