一种黄曲霉毒素在线进样分析方法技术

本发明专利技术公开一种黄曲霉毒素在线进样分析方法，包括以下步骤：样品提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱，此抗体与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2发生特异性抗原抗体结合，使其保留在该亲和柱上，其他杂质随流动相流出，通过加热使抗原抗体键断裂，以水洗脱目标化合物，洗脱液通过全自动真菌毒素前处理及在线进样平台在线进样到高效液相色谱仪，黄曲霉毒素得到充分分离，目标化合物经柱后衍生系统衍生，可以被荧光检测器检测，每一种黄曲霉毒素能分别得到准确的定量。本方法通过加热使抗原抗体键断裂，以水洗脱目标化合物，避免有机溶剂的使用，绿色环保；全自动操作，既提高了生产效率和重复性，又避免操作人员接触剧毒的黄曲霉毒素标准品。

Method for on-line injection analysis of aflatoxin

The invention discloses a aflatoxin online sample analysis method, which comprises the following steps: the sample extract was filtered, diluted filtrate after immune toxin specific antibody of Aspergillus flavus and the antibody affinity column, aflatoxin B1, B2, G1, G2 specific antigen antibody binding, which is retained in the the affinity column and other impurities with the mobile phase flow, by heating the antigen antibody bond rupture, off target compounds by washing, elution by automatic mycotoxin pretreatment and online sample platform online sample to HPLC, aflatoxin is fully separated, the target compound was confirmed by post column derivatization system derived. By fluorescence detector, each kind of aflatoxin can accurate quantitative respectively. This method enables the antigen antibody bond cleavage by heating, removal of the target compound by washing, avoid the use of organic solvent, the green environmental protection; full automatic operation, improves the production efficiency and reproducibility, and avoid the operator contact toxic aflatoxin standard.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测黄曲霉毒素的方法，特别是一种全自动在线进样分析方法。
技术介绍
真菌毒素是产毒真菌分泌的次生代谢产物。黄曲霉毒素(Aflatoxin)是毒性最强的真菌毒素，被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一类致癌物。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。黄曲霉毒素广泛存在于大米、玉米、花生、大豆等农产品和一些肉制品中，为此世界各国都规定了黄曲霉毒素B1在食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准。因此开发准确有效的食品中黄曲霉毒素的速测方法，对加强食品安全监管至关重要。现有黄曲霉毒素检测方法包括薄层层析法、免疫学分析法和仪器分析法。其中薄层层析法是最常用的检测方法，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、杂质干扰严重、无法精确定量，且对实验人员和环境污染较大。免疫学分析方法包括酶联免疫吸附法、放射免疫法和时间分辨荧光法。酶联免疫吸附法特异性强、灵敏度高、成本低、适于批量检测，但仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素B1)，而且易出现假阳性结果难以控制。放射免疫法存在放射污染，现应用较少。时间分辨荧光法检测灵敏度比前两者高，但前处理复杂，所需仪器昂贵，仅限于医学临床诊断领域使用。仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但要求黄曲霉毒素样品纯度高，样品前处理过程繁琐、耗时长，难以实现快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种克服了现有技术中样品前处理繁琐、耗时长、人工操作误差大、预处理过程中使用剧毒标品和多种有毒有机溶剂毒害操作人员和污染环境的问题的全自动黄曲霉毒素在线进样分析方法。为实现以上目的，本专利技术公开以下技术方案：一种黄曲霉毒素在线进样分析方法，其特征在于，包括以下步骤：样品提取液经过滤、稀释后，滤液经过
含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱，此抗体与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2发生特异性抗原抗体结合，使其保留在该亲和柱上，其他杂质随流动相流出，通过加热使抗原抗体键断裂，以水洗脱目标化合物，洗脱液通过全自动真菌毒素前处理及在线进样平台在线进样到高效液相色谱仪，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2得到充分分离，目标化合物经柱后衍生系统衍生，可以被荧光检测器检测，每一种黄曲霉毒素能分别得到准确的定量。作为一个优选方案，所述免疫亲和柱体积为0.2-0.8mL。作为一个优选方案，所述柱后衍生系统基于紫外光衍生。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术提供的黄曲霉毒素在线进样分析方法分析速度快，样品净化和进样分析可同时进行，平均每个样品只需9分钟，而现有技术要做到定量分析需几小时到几天时间；(2)检测范围广，灵敏度高，最低检测限(以黄曲霉毒素B1计)为5ppt；(3)采用单克隆抗体免疫技术，可特异性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分离出来，准确性、可靠性强，回收率高达80％以上；(4)免疫亲和柱柱体积小，溶剂用量少，大大缩短样品处理时间；(5)通过加热使抗原抗体键断裂，以水洗脱目标化合物，避免有机溶剂的使用，绿色环保；(6)全自动操作，全天候运行，一方面提高了生产效率和重复性，另一方面避免操作人员接触剧毒的黄曲霉毒素标准品；(7)该系统采用加热方式将黄曲霉毒素从免疫亲和柱使用纯水洗脱下来，可直接进液相系统分析，而传统黄曲霉毒素免疫亲和柱不能进行加热洗脱，只能用纯有机溶剂如甲醇进行洗脱，这样是不能直接进液相分析，就需要手动进样，不能实现自动分析，需要浪费分析时间。附图说明图1为黄曲霉毒素回归方程及相关系数。图2为加标回收结果。图3为黄曲霉毒素标准品色谱图(RP C18，250×4.6mm×5um，0.05ng/10mL)，出峰顺序依次为黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1。图4为黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1标准工作曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方
法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1.采用全自动真菌毒素前处理及在线进样平台及HPLC检测食品中黄曲霉毒1、试剂与仪器设备1.1 试剂配制1.1.1 样品提取溶剂：甲醇/水(4/1，v/v)。1.1.2 5mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH7.2)配制：1.1.2.1 称取50.14gNa2HPO4.12H2O溶解于700ml水中；1.1.2.2 称取9.66gNaH2PO4.1H2O溶解于350ml水中；1.1.2.3 将上述两种溶液进行混合并加入42.5gNaCl，配制成pH7.25mmol磷酸盐缓冲溶液。1.1.3 1mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH7.2)配制：取200ml的5mmol磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)稀释于800ml水中。1.1.4 甲醇/水：40/60。1.1.5 洗脱液：取溶剂A 10mL，加入到500mL蒸馏水里面，混匀。1.1.6 HPLC流动相配制：水/甲醇/乙腈(55/30/15,v/v)。1.1.7 11.2％甲醇/PBS溶液配制：取28mL甲醇，用1mmol的PBS缓冲溶液定容到250mL，混匀。1.1.8 黄曲霉毒素标准溶液：黄曲霉毒素G2：0.288ug/mL；G1：1.056ug/mL；B2：0.314ug/mL；B1：1.039ug/mL。1.2 仪器设备(1)全自动真菌毒素前处理及在线进样平台。全自动真菌毒素前处理及在线进样平台是上海磐合科学仪器股份有限公司的市售产品，在公司网站上有其产品信息的介绍。该平台带有全自动固相萃取、凝胶净化、在线/离线精确定量浓缩等多种组合，不仅适用于普通样品前处理更适用于黄曲霉毒素专业前处理。可将样品前处理及HPLC在线联机使用，使前处理与分析全自动化。全自动真菌毒素前处理及在线进样平台包括：1、固定支架，2、净化柱抓取器，3，净化柱加热器，4、高压液相进样阀配备700ul不锈钢定量环。净化柱加热器可加热温度为100℃，高压液相进样阀为二位六通阀。(2)HPLC系统，带荧光检测器(FLD)(3)UVE柱后衍生化系统(4)Aflaclean smart免疫亲和净化柱(5)高速匀浆机(6)高速离心机(7)50mL离心管2、实验步骤2.1 HPLC参考分析方法：黄曲霉毒素HPLC分析检测条件可参照以下设定：流动相：水/甲醇/乙腈55/30/15(v/v)；流速：1.2ml/min；柱温：36℃；HPLC分析柱：RP C18，250×4.6mm×5um；或LCTech专用柱150×4.6mm×5um；荧光检测器设置：激发波长EX.：365nm；发射波长Em.：460nm(使用UVE柱后衍生系统)。3、样品处理方法针对不同基质的样品，前处理方法有所不同。3.1 方法一：标准方法该处理程序适用于样品基质中没有干扰，主要适用于大多数谷类样品的处理。称取2.0g样品到50mL离心管中，并加入0.2g的氯化钠。先加入10mL提取溶剂(甲醇/水，4/1，v/v)，再高速均质机均质提取5min。将离心管在高速离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄曲霉毒素在线进样分析方法，其特征在于，包括以下步骤：样品提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱，此抗体与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2发生特异性抗原抗体结合，使其保留在该亲和柱上，其他杂质随流动相流出，通过加热使抗原抗体键断裂，以水洗脱目标化合物，洗脱液通过全自动真菌毒素前处理及在线进样平台在线进样到高效液相色谱仪，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2得到充分分离，目标化合物经柱后衍生系统衍生，可以被荧光检测器检测，每一种黄曲霉毒素能分别得到准确的定量。

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素在线进样分析方法，其特征在于，包括以下步骤：样品提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱，此抗体与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2发生特异性抗原抗体结合，使其保留在该亲和柱上，其他杂质随流动相流出，通过加热使抗原抗体键断裂，以水洗脱目标化合物，洗脱液通过全自动真菌毒素前处理及在线进样平台在线进样到高效液相色...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭子媛，亢磊，赵学伟，王宏，沈利华，蒋家奎，徐玮，
申请(专利权)人：上海磐合科学仪器股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31