本发明专利技术公开了小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，属于抗体偶联药物领域。环磷酰胺和液泡膜蛋白1抗体多肽的偶联结合物；所述液泡膜蛋白1抗体多肽为全新序列。偶联结合物制备步骤包括：（1）用0.1 mol/L HCl溶液配制2‑8mmol/L浓度的环磷酰胺；（2）4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应20‑30分钟；（3）用pH8‑10的缓冲液溶解所述的液泡膜蛋白1抗体多肽；（4）所述液泡膜蛋白1抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到9‑10；（5）4‑8℃，反应2小时；（6）PBS透析2天，即得。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。有益效果在于促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是抗体偶联药物领域。具体来说，本专利技术涉及液泡膜蛋白1抗体多肽偶联抗肿瘤药物环磷酰胺的结合物。
技术介绍
环磷酰胺是广谱抗肿瘤药，用于治疗白血病及其他肿瘤。其在体外无抗肿瘤活性，进入体内后先在肝脏中经微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺。而醛酰胺不稳定，在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。环磷酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰DNA及RNA功能，尤以对前者的影响更大，它与DNA发生交叉联结，抑制DNA合成，对S期作用最明显。临床用于恶性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌、肺癌等，有一定疗效。也可用于类风湿关节炎、儿童肾病综合征以及自身免疫疾病的治疗。尽管如此，环磷酰胺具有严重的毒副作用。常见副作用：1.骨髓抑制；2.静脉炎；3.消化道反应；4.脱发等。产生毒副作用的主要原因在于，环磷酰胺为广谱抗肿瘤要求，特异性较差，对正常细胞也具有一定的杀伤作用。因此，专利技术人希望能够将环磷酰胺与特异性的抗体偶联，从而产生肿瘤细胞的靶向作用，提高疗效，减少毒副作用。液泡膜蛋白1(Vacuole membrane protein 1，Vmp1)是新近发现的一类跨膜蛋白，在进化中高度保守，提示其可能参与蛋白间的相互作用和跨物种的重要生命活动。近年来的研究发现Vmp1为蛋白分泌、细胞器官形成及多细胞发育过程所必需，在诸多肿瘤相关的细胞学过程(包括细胞膜运输、生长增殖、自噬等)中发挥着关键的作用，提示Vmp1可能在肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。更重要的是，Vmp1是细胞-细胞间连接及紧密连接形成的重要成分，其在调控细胞粘附能力方面的强大功能，提示Vmp1可能参与HCC侵袭转移过程。研究发现，液泡膜蛋白1(Vacuole membrane protein 1，Vmp1)在肿瘤细胞表面高表达，因此，液泡膜蛋白1抗体可以靶向作用于肿瘤细胞表面，且本身具有抗乳腺癌的作用。但是液泡膜蛋白1抗体的分子量较大，具有抗原性，长期用于人体会产生中和反应，降低药效。因此，本专利技术提供了一种特异性强，纯度较高的小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺偶联的结合物，促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种特异性强，纯度较高的小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺偶联的结合物，促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。技术方案本专利技术的技术方案在于提供一种小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，其特征在于：环磷酰胺和液泡膜蛋白1抗体多肽的偶联结合物；所述液泡膜蛋白1抗体多肽为全新序列。所述偶联结合物的制备，步骤包括：(1)用0.1mol/L HCl溶液配制2-8mmol/L浓度的环磷酰胺；(2)4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应20-30分钟；(3)用pH8-10的缓冲液溶解所述的液泡膜蛋白1抗体多肽；(4)所述液泡膜蛋白1抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到9-10；(5)4-8℃，反应2小时；(6)PBS透析2天，即得。所述的液泡膜蛋白1抗体多肽采用化学合成法制备。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。优选为在制备用于治疗乳腺癌药物中的应用。有益效果本专利技术的小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，可用于促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高环磷酰胺在体内肿瘤组织的浓度；同时降低环磷酰胺在全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑等组织的分布；(2)显著性抑制肿瘤细胞的增殖；(3)降低环磷酰胺的毒性；(4)小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物能与肿瘤细胞的特异性结合；(5)提高荷瘤小鼠生存率。具体实施方式多肽由上海生工吉尔合成。实施例1制备液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物：用0.1mol/L HCl溶液配制2mmol/L浓度的环磷酰胺；4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应20分钟；用pH8的缓冲液溶解所述的液泡膜蛋白1抗体多肽；液泡膜蛋白1抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到9；在4℃，反应2小时；再用PBS透析2天，冻干，即得。实施例2制备液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物：用0.1mol/L HCl溶液配制8mmol/L浓度的环磷酰胺；4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应30分钟；用pH10的缓冲液溶解所述的液泡膜蛋白1抗体多肽；液泡膜蛋白1抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到10；在8℃，反应2小时；再用PBS透析2天，冻干，即得。实施例3用人乳腺癌移植瘤模型检测液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物的体内活力。6-8w龄SCID雌性小鼠，小鼠随机分成5组，每组10只。(1)空白组；(2)结合物低剂量组；(3)结合物中剂量组；(4)结合物高剂量组；(5)环磷酰胺阳性组。建立人乳腺癌移植瘤模型，在接种乳腺癌细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为结合物设3个剂量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，阳性组为0.2mmol/Kg的环磷酰胺，每天给药，连续14天。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，结合物可有效地保护荷瘤小鼠，在剂量0.05、0.1、0.2mmol/Kg时可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为40.98，68.92，79.01％。实施例4乳腺癌细胞的体外增殖率实验：采用MTT比色法。将对数生长的人乳腺癌细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h；实验分为5组，分别为空白组、阳性组和低中高剂量的实施例1得到的液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物；分别加入相同体积的DMEM培养基(HyClone，含胎牛血清20％)，环磷酰胺(1mmol/ml)和液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物(18、36、72μmol/ml)。每孔设五个复孔，培养48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成乳腺癌细胞抑制率＝(1—实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。环磷酰胺阳性组和实施例1的偶联结合物实验组的乳腺癌细胞的抑制率分别为82.7、57.06、76.1和92.5％(p＜0.05)。结果显示，实施例1的偶联结合物能有效抑制肿瘤细胞生长，高剂量结合物的肿瘤抑制率高于环磷酰胺。实施例5用人乳腺癌移植瘤模型检测液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物的体内分布。6-8w龄SCID雌性小鼠，小鼠随机分成3组，每组6只。(1)空白组；(2)结合物组；(3)环磷酰胺阳性组。建立人乳腺癌移植瘤模型，在接种乳腺癌细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为0.2mmol/Kg剂量的结合物，阳性组为0.2mmol/Kg的环磷酰胺，每天给药，连续7天。14天后，将小鼠处死后，分别取全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤等组织。全血肝素抗凝，将肝素抗凝血离心沉淀血细胞,取上清血浆0.5ml，加入2.67％HCLO4，离心沉淀血浆蛋白，上清水浴加热100℃20分钟，待测；各组织经过匀浆、除本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，其特征在于：环磷酰胺和液泡膜蛋白1抗体多肽的偶联结合物；所述液泡膜蛋白1抗体多肽的序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1. 一种小分子液泡膜蛋白1抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，其特征在于：环磷酰胺和液泡膜蛋白1抗体多肽的偶联结合物；所述液泡膜蛋白1抗体多肽的序列为SEQ ID NO：1。2. 根据权利要求1所述偶联结合物的制备，其特征在于：步骤包括：（1）用0.1 mol/L HCl溶液配制2-8mmol/L浓度的环磷酰胺；（2）4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应20-30分钟；（3）用pH8-10的缓冲液溶解所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗瑞雪，
申请(专利权)人：苏州普罗达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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