一种低密度脂蛋白受体相关蛋白6基因突变检测的试剂及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）基因突变检测的试剂、PCR检测方法及应用，属于基础生物研究及生物检测技术领域。检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5、NO.6；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7、NO.8。本发明专利技术从转录水平能快速发现Wnt信号通路下游LRP6基因突变情况，具有特异性强、灵敏度高等显著优点，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。

Reagent for detecting mutation of low density lipoprotein receptor related protein 6 gene and application thereof

The invention discloses a reagent for detecting mutation of low density lipoprotein receptor related protein 6 (LRP6) gene, a PCR detection method and an application thereof, belonging to the technical field of basic biological research and biological detection. Peptide nucleic acid detection reagents including sequence primer, peptide nucleic acid fluorescence probe and complementary wild type, such as forward primer sequence list SEQ ID NO.1, NO.3; reverse primer sequence list as SEQ NO.2, NO.4 ID; peptide nucleic acid fluorescent probes such as the order list SEQ NO.5, NO.6 ID; wild type complementary peptide nucleic acid sequences such as SEQ sequence list ID NO.7, NO.8. The invention can quickly find Wnt signaling pathways downstream of the mutation of LRP6 gene at the transcription level, with high specificity and sensitivity of obvious advantages, screening for anticancer drugs, and to provide tools to explore new drug target of basic scientific research.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及临床分子诊断
，特别是涉及一种低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)基因突变检测的试剂及应用。
技术介绍
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。LRP6蛋白是Wnt信号通路中β-catenin上游重要成员之一。其与配体结合后，激活Wnt信号通路，从而激活与细胞生长、增殖、分化等相关的靶基因，促进肿瘤细胞增殖。目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中LRP6蛋白均呈现不同程度的突变。目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段。近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及LRP6蛋白作为Wnt信号通路重要成员，其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题。尤其是在LRP6蛋白低密度脂蛋白受体结构域(LDLR)中发生的突变，对LRP6蛋白发挥功能启动非常重要的作用。例如在非小细胞肺癌细胞中检测出S148L突变，胰腺癌细胞中检测出R1269W突变等。肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。本方法采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中如何确定Wnt信号通路中的核心信号分子LRP6基因突变情况，以及如何解释核心分子LRP6在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了一种检测Wnt信号通路中LRP6基因突变检测试剂及应用。本专利技术的目的是提供一种用于LRP6基因突变检测的试剂，包括用于阻断野生型LRP6基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增S148L、R1269W突变型LRP6基因序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针：所述检测LRP6基因S148L突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述检测LRP6基因S148L突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述检测LRP6基因R1269W突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3；所述检测LRP6基因R1269W突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4；所述检测LRP6基因S148L突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5；所述检测LRP6基因R1269W突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.6；所述特异性结合包含LRP6基因148密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；所述特异性结合包含LRP6基因1269密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。本专利技术所述的检测试剂还包括PCR反应液、148密码子和1269密码子突变型参考品、含148密码子和1269密码子野生型参考品，其中PCR反应液包括：DEPC水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、oligo(dT)和含Mg离子的溶液。所述含148密码子突变型参考品为含SEQ NO.9的重组质粒DNA；所述含1269密码子突变型参考品为含SEQ NO.10的重组质粒DNA；所述含148密码子野生型参考品为含SEQ NO.11的重组质粒DNA；所述含1269密码子野生型参考品为含SEQ NO.12的重组质粒DNA；所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶；所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为：Taq酶0.01U/μL～0.05U/μL，dNTPs 0.2～0.6mM，10×PCR Buffer 1×，RNASIN40U/μL～60U/μL，M-MLV逆转录酶200U/μL～320U/μL，MgCl2 1.5～5.0mM，溶剂为DEPC水。具体地，所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述oligo(dT)终浓度为0.05～0.9μM，所述互补PNA序列终浓度为0.05～0.9μM，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μM。本专利技术所述的试剂进行实时荧光定量PCR的反应程序为：42℃逆转录20min；94℃预变性，2min；95℃变性，30s，58℃，45s(收集荧光)，进行40个循环。本专利技术的原理是通过构建与LRP6基因野生型互补的一段肽核酸PNA序列，当肽核酸PNA序列与LRP6基因互补结合时，任一突变均可导致PNA/DNA产生错配，从而使得溶解温度发生改变。进而根据LRP6基因突变型设计特异性的肽核酸PNA探针以及引物对LRP6突变型基因进行荧光定量PCR扩增，经过一轮的PCR扩增后，即可将LRP6基因突变型与野生型进行区分开来。进一步地，本专利技术还提供了所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，所述癌细胞为非小细胞肺癌、胰腺癌。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是：LRP6基因是Wnt信号通路中β-catenin蛋白上游发挥着重要功能的基因，本专利技术提供了直接检测Wnt信号通路中LRP6基因突变检测的试剂，借助于所述检测试剂能够通过实时荧光定量PCR法在转录水平快速检测出LRP6基因的突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于低密度脂蛋白受体相关蛋白6 LRP6基因突变检测的试剂，其特征在于，包括用于阻断野生型LRP6基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增S148L、R1269W突变型LRP6基因序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针：所述检测LRP6基因S148L突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述检测LRP6基因S148L突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述检测LRP6基因R1269W突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3；所述检测LRP6基因R1269W突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4；所述检测LRP6基因S148L突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5；所述检测LRP6基因R1269W突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.6；所述特异性结合包含LRP6基因148密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；所述特异性结合包含LRP6基因1269密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5， 3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。...

【技术特征摘要】
1.一种用于低密度脂蛋白受体相关蛋白6 LRP6基因突变检测的试剂，其特征在于，包括用于阻断野生型LRP6基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增S148L、R1269W突变型LRP6基因序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针：所述检测LRP6基因S148L突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述检测LRP6基因S148L突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述检测LRP6基因R1269W突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3；所述检测LRP6基因R1269W突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4；所述检测LRP6基因S148L突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5；所述检测LRP6基因R1269W突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.6；所述特异性结合包含LRP6基因148密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；所述特异性结合包含LRP6基因1269密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5， 3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。2.根据权利要求1所述的用于低密度脂蛋白受体相关蛋白6 LRP6基因突变检测的试剂，其特征在于，所述的检测试剂还包括PCR反应液、148密码子和1269密码子突变型参考品、148密码子和1269密码子野生型参考品；其中PCR反应液包括： DEPC水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、oligo（dT）和...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐景峰，陈兴珍，周策凡，张毅，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42