一种阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用，属于非病毒基因载体制备领域。所述阳离子脂质类化合物，其化学结构如通式(I)所示，本发明专利技术的化合物与DOPE或DOPC或卵磷脂按3～1：1～3的摩尔比例混合，溶解在氯仿可用于制备脂质体基因载体，该载体粒径均匀，分散性良好，制作成本低，细胞毒性低，转染外源基因能力强。本发明专利技术的化合物可作为制备基因载体的原料，弥补目前非病毒核酸载体普遍存在细胞转染率低、细胞毒性大、价格昂贵等问题，具有良好的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因载体制备与应用领域，具体涉及一种阳离子脂质类化合物及其制备方法以及在制备基因载体中的应用。
技术介绍
核酸转染是指将外源的核酸(包括质粒[plasmid DNA]、小干扰RNA[siRNA]、反义核酸[antisense nucleic acids]、微小RNA[microRNA]等)导入细胞内，使其在细胞内发挥生物学功能，从而达到调控基因表达的目的。基因治疗(gene therapy)是指将目的基因(通常是质粒DNA)导入细胞内，使其表达具有活性的蛋白，从而治疗由基因突变或基因缺陷引起的病变。例如，脂蛋白酶酯酶缺乏症是基因突变引起的；携带野生型脂蛋白酶酯酶基因的腺病毒(AVV)类的基因药物Glybera能够将正常基因传送到肌肉细胞内并表达具有生物活性的LPL蛋白，从而降低血液内的脂肪浓度。因为核酸带有强负电荷，而细胞表面也带负电荷，所以裸露的核酸很难穿过细胞膜进入细胞内。要想让核酸进入细胞内发挥作用，必须借助合适的载体。开发安全高效的输送载体是基因治疗(DNA输送)在临床应用的前提。基因载体可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒(viral vector)载体容易在体内容易引起机体的免疫原性，还存在着引起插入型基因突变和癌变等潜在隐患。所以，病毒在核酸传送领域的进一步应用研究极大地受到了限制，这使得以非病毒作为核酸传送载体的研究成为必然。非病毒(non-viral vector)载体传送法通常采用的材料包括脂质体，多肽，蛋白质，以及阳离子型高分子等。与病毒传递方法相比较，使用非病毒传送核酸可以避免免疫刺激
和癌变等副作用，然而目前非病毒核酸载体普遍存在细胞转染率低、细胞毒性大、价格昂贵等问题。因此，开发高效、低毒、廉价的非病毒基因载体具有重要意义。
技术实现思路
针对本领域技术的不足之处，本专利技术的目的是提供一种细胞毒性低、细胞转染效率高、制备方法简单的基因载体。本专利技术的另一目的是提供所述基因载体的制备方法与应用。实现本专利技术上述目的的具体技术方案为：一种阳离子脂质类化合物，其化学结构如通式(I)所示：式中R1为R3选自以下基团：R2选自H、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸或组氨酸的残基；如：X、Y为NH、O或S；n为1或2，m为3或4。优选地，本专利技术的阳离子脂质类化合物为：优选地，本专利技术的阳离子脂质类化合物为：本专利技术提供了上述化合物在制备基因载体中的应用。具体地，是将本专利技术的化合物与DOPE或DOPC或卵磷脂按3～1：1～3的摩尔比例混合，溶解在氯仿中，用氮气流吹干后真空干燥过夜。加入pH7.2的PBS，用Avanti Mini-Extruder脂质体挤出器制备得到载体，在4℃冰箱内保存。本专利技术提供了上述化合物在制备基因治疗药物中的应用。含有上述化合物的基因载体属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了含有上述化合物的基因载体在核酸转染中的应用。本专利技术提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)化合物I或II的合成：将饱和或不饱和烃基氨或醇、Boc-谷氨酸-OH或Boc-天冬氨酸-OH溶于有机溶剂中，在氮气保护下加入缩合剂，在0～35℃下搅拌12～24h后，蒸馏除去有机溶剂，加过量酸，在室温搅拌1～2h后蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化得到化合物I即谷氨酸的饱和或不饱和烃基取代酯或酰胺，或得到化合物II即天冬氨酸的饱和或不饱和烃基取代酯或酰胺；(2)化合物III或IV的合成：1)将Boc-鸟氨酸、Boc-鸟氨酸(Boc)-Osu或Boc-赖氨酸、Boc-赖氨酸(Boc)-OSu在碱性条件下有机溶剂中在0～35℃下搅拌24～36h，蒸馏除去有机溶剂后用硅胶柱层析法分离纯化得到中间体Boc-鸟氨酸(Boc)-鸟氨酸(Boc)-OH，或Boc-赖氨酸(Boc)-赖氨酸(Boc)-OH；所述的Boc是碳酸二叔丁酯；其中m为3或4；2)将1)得到的中间体、N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂在有机溶剂中搅拌12h，再加入Boc-鸟氨酸，或Boc-赖氨酸，在0～35℃下继续搅拌12～24h后蒸馏除去有机溶剂后用硅胶柱层析法分离纯化得到化合物III，即Boc-鸟氨酸(Boc)-鸟氨酸(Boc)-鸟氨酸(Boc)-COOH，或得到化合物IV，即Boc-赖氨酸(Boc)-赖氨酸(Boc)-赖氨酸(Boc)-COOH其中m为3或4；化合物I与化合物III、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，四者的摩尔比为1:1:2:2或化合物II与化合物III、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，四者的摩尔比为1:1:2:2或胆固醇与化合物III、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，四者的摩尔比为2：1：2：2或化合物I或化合物II与化合物IV、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，四者的摩尔比为1:1:2:2或胆固醇与化合物IV、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，四者的摩尔比为2：1：2：2，溶剂量以其完全溶解为限，在氮气保护下冷却至0℃后在室温下搅拌24小时，之后将反应混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％柠檬酸溶液、水、饱和盐水洗涤，干燥后纯化目的物；上述式中，R3选自以下任一个基团：n为1或2；m为3或4。上述方法中，所述的有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、苯、甲苯；上述方法中，每个化学反应均使用碱性催化剂，所述碱性催化剂包括三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，每一步化学反应完成后，均对产物采用硅胶柱层析进行纯化，硅胶柱层析用的有机溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈按照不同配比混合所得的溶剂体系。所述的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二
环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、羰基二咪唑。步骤(1)所述的过量酸包括盐酸、磷酸、甲磺酸和/或三氟乙酸。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述含有阳离子脂质类化合物具有以下优点：(1)制备工艺简单、产率高；(2)本脂质类分子水溶性高、与质粒DNA结合力强、易形成脂质体；(3)特定比例的α-氨基和δ-氨基，如α-氨基：δ-氨基为2～4：1，使本脂质类化合物具有极高的生物相容性、与市面上现有的转染试剂(如，lipofectamine2000、lipofectamine3000、PEI等)相比较，本脂质类分子的细胞毒性明显低于前者；(4)基因(质粒DNA)转染效率高、由于毒性低，在转染过程中不需要换培养基，有效降低细胞培养及基因转染的成本。利用本专利技术的化合物制备得到的基因载体粒径在100nm左右，大小均一，分散性良好；采用凝胶电泳阻滞实验检测脂质基因载体与siRNA的结合能力，结果显示，当N/P比例大于或等于2时，载体能够有效的阻滞质粒的电泳，包裹能力强；本专利技术的基因载体具有很低的细胞毒性，转染4小时后细胞存活率达到90％，明显高于商品化的脂质体lipofectamine 2000；本专利技术的基因载体与GFP表达质粒混合的复合物，其转染能力强，略高于lipofectamine 2000的转染能力。附图说明图1为由实施例3所得脂类分子化合物制得的基因载体形成的脂质体粒度分布。图2为使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阳离子脂质类化合物，其特征在于，其化学结构如通式(I)所示：式中R1为R2选自H、赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸的残基；R3选自以下任一个基团：X、Y为NH、O或S；n为1或2，m为3或4。

【技术特征摘要】
1.一种阳离子脂质类化合物，其特征在于，其化学结构如通式(I)所示：式中R1为R2选自H、赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸的残基；R3选自以下任一个基团：X、Y为NH、O或S；n为1或2，m为3或4。2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其为：3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其为：4.权利要求1-3任一所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)化合物I或化合物II的合成：将饱和或不饱和烃基氨或醇、Boc-谷氨酸-OH或Boc-天冬氨酸-OH溶于有机溶剂中，在氮气保护下加入缩合剂反应生成化合物I，即谷氨酸的饱和或不饱和烃基取代酯或酰胺，或反应生成化合物II，即天冬氨酸的饱和或不饱和烃基取代酯或酰胺；反应方程式为：其中R3选自以下任一个基团：n为1或2；(2)化合物III或化合物IV的合成：1)将Boc-鸟氨酸、Boc-鸟氨酸(Boc)-Osu或Boc-赖氨酸、Boc-赖氨酸(Boc)-OSu在碱性条件下有机溶剂中反应得到中间体，即Boc-鸟氨酸(Boc)-鸟氨酸(Boc)-OH，或Boc-赖氨酸(Boc)-赖氨酸(Boc)-OH；所述的Boc是碳酸二叔丁酯；反应方程式为：其中m为3或4；2)将1)得到的中间体、N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂在有机溶剂中搅拌，再加入Boc-鸟氨酸，或Boc-赖氨酸进行反应得到化合物III，即Boc-鸟氨酸(Boc)-鸟氨酸(Boc)-鸟氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡日查，海小，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15