本发明专利技术涉及一种电化学发光夹心生物传感器及其制备与应用，包括以下步骤：先采用恒电位法制备金纳米‑石墨烯修饰的玻碳电极；再制备Ru(bpy)32+标记的信标Ru‑TBA2‑AuNPs；将金纳米‑石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育20 min；最后在Ru‑TBA2‑AuNPs中培育20 min。本发明专利技术的电化学发光夹心生物传感器主要应用于凝血酶的检测。本发明专利技术的传感器具有良好的稳定性、重现性、对凝血酶具有很强的特异性，不易受到检测样品中其他物质的干扰；灵敏度高、检测快速、操作简便等特点。对凝血类药物的研发有一定的帮助。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析化学与电化学发光传感器分析领域，具体涉及一种基于金纳米-石墨烯复合材料和适配体的检测凝血酶的电化学发光生物传感器以及制备方法与应用。
技术介绍
凝血酶主要是指凝血级联效应蛋白酶。它主要进行循环纤维蛋白原转化为纤维白体，然后聚合成纤维蛋白，即血栓纤维素。人类的凝血酶主要用于在出现外伤时帮助凝血。检测在血液中的凝血酶含量的必要性不仅是为了那些遭受凝血功能异常疾病的病人，也是为了检验治疗药物在外科手术和血栓疾病的处理的效果。因此，灵敏的、准确的凝血酶检测方法在疾病预防中是关键和有用的。适配体是一些天然的单链DNA或者RNA。他们折叠成二级和三级结构，使凝血酶能够以非常高效和特异性地结合一些目标分子（小分子、核酸、蛋白质或者整个细胞）。适配体通常通过系统的演化指数富集配体（SELEX）。与传统的识别元素——抗体相比，适配体有许多独特的特点例如最小的免疫原性、合成方便、容易化学修饰、结构稳定有柔性。这些特点使适配体成为了发展适配体为基础的分析方法的一种理想的候选者。这些方法包括电化学发光法（ECL），电化学法，荧光法以及比色法。到目前为止，有两种凝血酶适配体已经得到了广泛的应用，一种是TBA1能够结合凝血酶的纤维蛋白原位点，结合常数Kd在100 nM左右。另一种是TBA2更好的结合凝血酶（Kd=0.5 nM）。与其他方法相比，电化学发光法结合了电化学和化学发光法的优点，例如低的背景信号，容易控制和低的检测限。结合电化学发光的有点和适配体的特异性的特点，适配体电化学发光传感器已经变成了一种重要的有前景的检测方法。由于Ru(bpy)32+/TprA体系出色的稳定性和很高的发光效率，Ru(bpy)32+/TprA体系得到了很好的研究。尤其在基于提高Ru(bpy)32+/TprA体系发光性能方面做了深入的研究。纳米材料比如碳纳米管、石墨烯、金纳米以及纳米复合材料用来放大电化学发光信号的应用已经在电化学发光传感器中的得到了广泛的应用。最近石墨烯已经以石墨烯为基础的纳米复合材料在构建电子元件中得到了广泛的重视，像在激光发射、太阳能电池。这些电子元件大多都需要一些轻薄以及电子传导效率高的材料。石墨烯是一种单原子层厚的石墨材料，而且石墨烯-金属复合材料拥有出色的物理化学性质比如大的比表面积、可控的电子性质。这些性质让石墨烯-金属复合材料在构建电化学发光传感器中已经成为了有前景的电极材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种电化学发光夹心生物传感器及其制备与应用以解决目前对凝血酶的检测设备和处理过程复杂、价格昂贵、灵敏度不高等问题。一种电化学发光夹心生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：（S1）采用恒电位法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极；（S2）采用柠檬酸还原氯金酸法制备AuNPs；（S3）用Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记TBA2并溶解于PBS溶液中，得到Ru-TBA2信标；（S4）将步骤（S3）所得Ru-TBA2信标用TCEP（磷酸三氯乙酯）和pH为5.2的醋酸盐缓冲溶液预处理1 h以断开巯基之间形成的双硫键；（S5）将步骤（S2）所得AuNPs加入用NaOH处理过的玻璃瓶中，再加入步骤（S4）所得Ru-TBA2，在室温遮光下培育16 h后加入pH为8.2 的Tris-醋酸盐缓冲溶液和NaCl，继续在温室遮光下培育24 h；离心除去多余的Ru-TBA2；把得到的Ru-TBA2-AuNPs溶解到PBS缓冲溶液中；（S6）将所述步骤（S1）所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育20 min；最后在步骤（S5）所得Ru-TBA2-AuNPs中培育20 min。金纳米-石墨烯复合材料，既有石墨烯具有的良好性质，独特的结构使其具有优异的电学、热学、力学以及化学性质，而且在金纳米的相互作用下，这些性质有明显的增强。而且金纳米能够提供巯基修饰DNA分子修饰的位点。在本专利技术中，电极表面的金纳米和巯基修饰的适配体TBA1通过Au-S化学键结合可以有效的固定适配体TBA1。另一方面金纳米-石墨烯复合材料可以大大增大电极的电子传导效率，这样就可以增大电化学发光信号的响应。Ru(bpy)32+是一种稳定的、发光效率非常高的发光试剂，由于其分子量和分子空间体积较酶等标记小很多，且不影响核酸的特异性和杂交活性，使得Ru(bpy)32+在分子水平上对核酸进行标记而成为可能。再加上Ru(bpy)32+可在电化学发光反应中进行再生循环反应，使得一个标记物在每一个检测周期中会产生相当数量的光子，因而分析灵敏度很高。在本专利技术的方法中利用Ru(bpy)32+标记TBA2不仅不会影响适配体TBA2与凝血酶的结合，而且还还能增强检测反应的灵敏度。在本专利技术中，在溶液中，利用金纳米颗粒连接修饰有Ru(bpy)32+的TBA2，由于一个金纳米颗粒可以连接很多数量的TBA2分子从而形成一种放射状的电化学发光信号源（Ru-TBA2-AuNPs），那当体系中出现少量的凝血酶时，就会引入大量的发光试剂，这样进一步对电化学发光信号的响应进行了放大。通过本专利技术制备的电化学发光生物传感器，由于Ru(bpy)32+标记在适配体TBA2上，进而TBA2与金纳米形成Ru-TBA2-AuNPs的信号大分子。适配体TBA1通过Au-S化学键连接在修饰有金纳米-石墨烯的电极表面。当体系中出现凝血霉时，凝血酶就会和TBA1和TBA2结合，从而把Ru-TBA2-AuNPs引入到电极表面，通过电化学发光信号的增强来实现对凝血酶的定量检测。生物分子需要一定的电解质环境，氯化钠主要提供电解质环境。进一步的，所述巯基修饰的TBA1序列为5’-SH-(CH2)6-TTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3’；所述Ru-TBA2信标的序列为5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTAGGGCAGGTGGGGGG TGACTT-(CH2)6-NH2-3’。进一步的，所述柠檬酸还原氯金酸法制备AuNPs主要包括：取氯金酸溶液于容器中加热至沸腾，然后快速加入柠檬酸钠；继续加热并不停的搅拌直到溶液的颜色由黄色变成红色，再不停的搅拌溶液冷却到室温，储存在4 °C下备用。进一步的，所述恒电位法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极主要包括： 采用氧化石墨烯和氯金酸，在电位为-1.1 V下恒电位沉积到玻碳电极600～1000 s。使用玻碳电极前先将玻碳电极用α-A12O3抛光粉抛光；洗涤，分别在去离子水和乙醇中超声10 min。进一步的，所述Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的合成主要包括以下步骤：（S11）将Ru(bpy)2Cl2、碳酸氢钠和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸混合均匀，加入乙醇-水溶液中加热回流后冷却过滤制备Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；（S12）再将N,N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌混合后加入DMF溶液使其充分溶解后加入Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2中合成Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。进一步的，步骤（S5）制备所得Ru-TBA2-AuNPs的浓度为2～8 μM；步骤（S2）制备得到的AuNPs粒径为6-10 nm。Ru本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种电化学发光夹心生物传感器的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（S1）采用恒电位法制备金纳米‑石墨烯修饰的玻碳电极；（S2）采用柠檬酸还原氯金酸法制备AuNPs；（S3）用Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记TBA2并溶解于PBS溶液中，得到Ru‑TBA2信标；（S4）将步骤（S3）所得Ru‑TBA2信标用TCEP和pH为5.2的醋酸盐缓冲溶液预处理1 h；（S5）将步骤（S2）所得AuNPs加入用NaOH处理过的玻璃瓶中，再加入步骤（S4）所得Ru‑TBA2，在室温遮光下培育16 h后加入pH为8.2 的Tris‑醋酸盐缓冲溶液和NaCl，继续在温室遮光下培育24 h；离心除去多余的Ru‑TBA2；把得到的Ru‑TBA2‑AuNPs溶解到PBS缓冲溶液中；（S6）将所述步骤（S1）所得到金纳米‑石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育20 min；最后在步骤（S5）所得Ru‑TBA2‑AuNPs中培育20 min。
【技术特征摘要】
1.一种电化学发光夹心生物传感器的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（S1）采用恒电位法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极；（S2）采用柠檬酸还原氯金酸法制备AuNPs；（S3）用Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记TBA2并溶解于PBS溶液中，得到Ru-TBA2信标；（S4）将步骤（S3）所得Ru-TBA2信标用TCEP和pH为5.2的醋酸盐缓冲溶液预处理1 h；（S5）将步骤（S2）所得AuNPs加入用NaOH处理过的玻璃瓶中，再加入步骤（S4）所得Ru-TBA2，在室温遮光下培育16 h后加入pH为8.2 的Tris-醋酸盐缓冲溶液和NaCl，继续在温室遮光下培育24 h；离心除去多余的Ru-TBA2；把得到的Ru-TBA2-AuNPs溶解到PBS缓冲溶液中；（S6）将所述步骤（S1）所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育20 min；最后在步骤（S5）所得Ru-TBA2-AuNPs中培育20 min。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述巯基修饰的TBA1序列为5’-SH-(CH2)6-TTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3’；所述Ru-TBA2信标的序列为5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTAGGGCAGGTGGGGGG TGACTT-(CH2)6-NH2-3’。3. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述柠檬酸还原氯金酸法制备AuNPs主要包括：取氯金酸溶液于容器中加热至沸腾，然后快速加入柠檬酸钠；继续加热并不停的搅拌直到溶液的颜色由黄色变成红色，再不停的搅拌让溶液冷却到室温，储存在4 °C下备用。4.根据权利要求1所述制备方...
【专利技术属性】
技术研发人员：高文华，李英杰，陈耀文，鲁福身，陈汉佳，徐严平，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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