抗CD4蛋白单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.9576)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB64。本发明专利技术还涉及单克隆抗体UMAB64在制备用于检测CD4蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB64的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB64在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与CD4蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了CD4蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及可特异结合CD4蛋白的单克隆抗体UMAB64、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。
技术介绍
CD4蛋白是一种单链跨膜糖蛋白，蛋白的相对分子量约55kD。主要表达于辅助/诱导性T淋巴细胞(CD4+)表面，如：Th1/Th2、抑制或细胞毒性T细胞亚群。CD4常应用于某些T细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、Langerhans细胞组织细胞增生等疾病的检测与分型。目前临床上通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中CD4蛋白的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合CD4蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对CD4蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种结合特异性较高的CD4蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测CD4蛋白的免疫检测工具中的应用。本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2014年8月22日，保藏编号为CGMCC No.9576。本专利技术还提供了一种特异性结合CD4蛋白的单克隆抗体UMAB64，由上述杂交瘤细胞株产生。本专利技术所述单克隆抗体的制备方法如下：(1)重组表达载体的构建：根据CD4ORF核苷酸序列(CD4ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1374bp；CD4氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建CD4重组表达质粒；(2)CD4重组蛋白的表达与纯化：将CD4重组表达质粒转化HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的CD4重组蛋白；(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的CD4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CD4特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB64，亚型鉴定为IgG2b；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得CD4单克隆抗体UMAB64。分别通过Western Blot、免疫组化实验、免疫荧光实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。本专利技术将所述单克隆抗体UMAB64与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发所述明单克隆抗体UMAB64特异性结合CD4蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。本专利技术还提供了单克隆抗体UMAB64在制备用于检测CD4蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。在具体的实施例中，本专利技术提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB64，可检测组织细胞中CD4的表达状况。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与CD4的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于T细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、Langerhans细胞组织细胞增生。与现有技术相比，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.9576)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB64。本专利技术还提供了单克隆抗体UMAB64在制备用于检测CD4蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB64的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB64在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本专利技术所述单克隆抗体可与CD4蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了CD4蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内CD4蛋白表达水平，可应用于T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、Langerhans细胞组织细胞增生等疾病的辅助诊断与分型。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB64的分类命名为：CD4鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年8月22日；保藏编号：CGMCC No.9576。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为ORF区；图2示实施例2CD4蛋白Western blot检测结果图，以anti-DDK检测CD4蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pCMV6-CD4质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；图3示实施例2CD4蛋白SDS-PAGE结果图；图4示实施例3以单克隆抗体UMAB64识别内源CD4蛋白的Western blot检测结果图，其中泳道HL-60和泳道SW-620分别为(以以单克隆抗体UMAB64检测CD4蛋白在HL-60与SW-620细胞中的表达；图5示实施例4人正常淋巴结组织免疫组化结果图(一抗为CD4单克隆抗体UMAB64)；图6示实施例4人淋巴瘤组织免疫组化结果图(一抗为CD4单克隆抗体UMAB64)；图7示实施例4人正常扁桃体组织免疫组化结果图(一抗为CD4单克隆抗体UMAB64)；图8示实施例5OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为CD4单抗UMAB64，1:100；二抗为DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，1:400)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1、CD4重组表达质粒的构建以从美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)获得的质粒BC206453(含CD4ORF 1374bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立CD4重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。实施例2、CD4重组蛋白的表达与纯化1、转染HEK293T细胞：HEK293T细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mLDMEM(无血清及抗生素)至50mL管中，加入300μLPEI MegaTran1.0混匀；加入75μg CD4重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合CD4蛋白的单克隆抗体UMAB64，由保藏编号为CGMCC No.9576的杂交瘤细胞株产生。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合CD4蛋白的单克隆抗体UMAB64，由保藏编号为CGMCC No.9576的杂交瘤细胞株产生。2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9576。3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测CD4蛋白的免疫检测工具中的应用。4.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何为无，马东晖，魏海涛，袁克湖，陈才伟，刘晓玲，陈坚，舒幼敏，王广利，周春，戚莉莉，
申请(专利权)人：北京傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11