一种支原体的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种支原体的检测方法及检测试剂盒。所述检测方法将PCR技术与ELISA技术相结合，是一种半定量核酸检测技术，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、灵敏度提高、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。所述检测试剂盒，结构简单，操作方便，能够一次性满足所述检测方法需要的试剂，提高了实验人员的工作效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检测分析
，具体涉及一种支原体的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
支原体(Mycoplasma)是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，是目前所知能在无生命培养基中生长繁殖的最小的微生物。支原体感染造成的危害非常广泛，可引起人、动物、植物和昆虫等多种疾病，已受到人们的广泛重视。但基于支原体具有菌体形态小、多样、生长缓慢及支原体种属间交叉抗原的存在等生物学特性，限制了支原体检测的一些简单直观的方法。目前，现有技术中最先进的是使用PCR法检测支原体，PCR法检测支原体主要是依据原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区各生物种间的碱基序列差别很大，以支原体16S rRNA和16S-23S之间的内转录区以及23S rRNA的DNA设计的引物进行套式PCR扩增，通过溴化乙锭琼脂糖跑胶检测。PCR法是利用PCR技术，模拟体内DNA复制的体外扩增方法，对一些难以用培养法和血清学法检测的支原体，更能显现出其高效、灵敏的特异性。但在PCR法检测支原体中，因为PCR技术本身的缺陷，也存在一些问题，如：易发生污染、易发生交叉反应、产生假阳性假阴性结果等。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种支原体的检测方法及检测试剂盒。所述检测方法将PCR技术与ELISA技术相结合，是一种半定量核酸检测技术，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、灵敏度提高、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。本专利技术所采用的技术方案为：一种支原体的检测方法，包括以下步骤：A、取待测样品：取待测细胞上清液作为样本；B、PCR反应：以步骤A中的上清液为模板，进行PCR反应，得到PCR反应产物；C、ELISA反应：对步骤B中得到的PCR反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量所述PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；D、确定样品浓度：根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照所述关系曲线，根据所述PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据所述PCR反应产物的浓度，计算得到所述待测样品的浓度。所述检测方法将PCR技术与ELISA技术相结合，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、灵敏度提高、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。步骤A中，取培养时间为3-7天的细胞培养液的上清液作为样本。步骤B中，使用被荧光标记的引物，所使用的引物的荧光标记方法为：用5’端标记生物素的引物用于PCR扩增，PCR反应双链产物的一条链便带有生物素，所述生物素作为标记物。需要说明的是，在本专利技术中的步骤C中，所述生物素能够与酶标板上包被的亲和素结合，PCR反应产物在变性后，去除另一条未标记链，再加入地高辛标记的探针，与结合在酶标板上的单链特异性杂交，然后再加入酶标抗地高辛抗体，与探针上的地高辛结合，然后显色，测定OD值，已完成整个试验流程。本专利技术中，使用改造后的引物对PCR产物进行标记，并在后续的ELISA反应方便测定OD值，将PCR反应和ELISA反应有机地结合起来。另外，步骤B中，PCR反应体系包括引物、dNTP mixture、Buffer、Takara Ex Taq和样本，所述PCR反应体系的总体积为25μL，其中各组分的含量或浓度为：引物浓度为10pmol/ul，dNTP mixture的浓度均为2.5mmol/L，样本含量2μL，余量为水。步骤B中，PCR反应中使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性1min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下预变性1min，在55℃温度下退火2min。在72℃温度下延伸1min；在完成35个循环之后，即完成PCR扩增程序。当然，对于本领域的技术人员，能够根据现有技术，做出其他的PCR反应体系的配比和反应程序，在此就不在赘述。步骤C中，所述ELISA反应为：对步骤B中得到的PCR反应产物和不同浓度的标准品分别加入到附有亲和素的酶标板上，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；然后在所述酶标版上加入一抗，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；然后在酶标版上加入二抗，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；孵育完成后，加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺，避光；最后加入停止液，终止反应后分别测量所述PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值。优选地，步骤C中，每次清洗使用1XWashing Buffer洗3次。进一步地，步骤B中，增加阳性对照组：所述阳性对照组加入阳性模板，其余设置与步骤B中的所述PCR反应设置相同。在本专利技术中，阳性对照主要是确认样品中是否有阻碍物，不含有支原体的内部序列，为人工合成。使用阳性对照时，扩增片段大小为800bp，如果使用阳性对照时没有片段扩增，说明检测样品中有阻碍物，需对检测样品进行DNA提取，再以其为模板进行扩增。本专利技术还提供了一种用于支原体的检测方法的检测试剂盒，包括盒体、试剂瓶、八连管和八连管架，所述盒体的底部设置有固定层，所述固定层上开设有多个固定孔，所述试剂瓶设置在固定孔内，所述试剂瓶包括PCR反应液试剂瓶、阳性模板试剂瓶、标准品试剂瓶、稀释液试剂瓶、清洗液试剂瓶、一抗试剂瓶、二抗试剂瓶、显色液试剂瓶和终止液试剂瓶；所述八连管和八连管架设置在所述盒体的内部。所述PCR反应液试剂瓶中装有PCR反应液试剂，阳性模板试剂瓶中装有阳性模板试剂，标准品试剂瓶中装有标准品试剂，稀释液试剂瓶中装有稀释液试剂，清洗液试剂瓶中装有清洗液试剂，一抗试剂瓶中装有一抗试剂，二抗试剂瓶中装有二抗试剂，显色液试剂瓶中装有显色液试剂，终止液试剂瓶中装有终止液试剂。所述PCR反应液试，极为除PCR反应模板之外，PCR反应体系中的其他通用试剂的混合液。本专利技术中ELISA反应的原理为：酶联免疫吸附实验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起化学反应而呈现颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比，通过酶标仪检测吸光值，画出标准品吸光值-浓度曲线，便可根据样品的吸光值计算出所测样品的含量。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术提供了一种支原体的检测方法，所述检测方法将PCR技术与ELISA技术相结合，是一种半定量核酸检测技术，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、灵敏度提高、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。2、所述检测试剂盒，结构简单，操作方便，能够一次性满足所述检测方法需要的试剂，提高了实验人员的工作效率。附图说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种支原体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、取待测样品：取待测细胞上清液作为样本；B、PCR反应：以步骤A中的上清液为模板，进行PCR反应，得到PCR反应产物；C、ELISA反应：对步骤B中得到的PCR反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量所述PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；D、确定样品浓度：根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照所述关系曲线，根据所述PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据所述PCR反应产物的浓度，计算得到所述待测样品的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种支原体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、取待测样品：取待测细胞上清液作为样本；B、PCR反应：以步骤A中的上清液为模板，进行PCR反应，得到PCR反应产物；C、ELISA反应：对步骤B中得到的PCR反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量所述PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；D、确定样品浓度：根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照所述关系曲线，根据所述PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据所述PCR反应产物的浓度，计算得到所述待测样品的浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中，取培养时间为3-7天的细胞培养液的上清液作为样本。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，使用被荧光标记的引物，所使用的引物的荧光标记方法为：用5’端标记生物素的引物用于PCR扩增，PCR反应双链产物的一条链便带有生物素，所述生物素作为标记物。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，PCR反应体系包括引物、dNTP mixture、Buffer、Takara Ex Taq和样本，所述PCR反应体系的总体积为25μL，其中各组分的含量或浓度为：引物浓度为10pmol/ul，dNTP mixture的浓度均为2.5mmol/L，样本含量2μL，余量为水。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，PCR反应中使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性1min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下预变性1min，在55℃温度下退火2min；在72℃温度下延伸1min；在完成35个循环之后，即完成PCR扩增程...

【专利技术属性】
技术研发人员：董坚，杨益，刘玉芝，何群，蔡敏，方捷，
申请(专利权)人：武汉思安医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42