鹿流行性出血病病毒实时荧光RT‑PCR检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术目的在于提供一种鹿流行性出血病病毒实时荧光RT‑PCR检测试剂盒，包括盒体、海绵垫，所述海绵垫上设有5×RT‑PCR反应液容器孔，内设有5×RT‑PCR反应液；酶混合液容器孔，内设酶混合液；正反向引物容器孔，内设正反向引物；探针容器孔，内设探针；阳性对照品孔，内设阳性对照品；阴性对照品孔，内设阴性对照品；无核酸酶水容器孔，内设无核酸酶水。该检测试剂盒根据EHDV群特异性结构蛋白VP7基因cDNA为靶序列设计引物和探针，为鹿流行性出血病病毒检测提供一种特异性强，敏感性高，快速、准确的检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本技术属于生物检测
，具体涉及一种病毒实时检测试剂盒。
技术介绍
鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer，EHD)是一种季节性非接触性的病毒性传染病，由鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer，EHDV)引起的，以引起鹿体温升高、黏膜和浆膜面广泛出血并常处于昏迷状态下死亡为特征的严重致死性传染病。在自然条件下，EHDV可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染，严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展。EHD是重要的虫媒病之一，库蠓是主要的传播媒介。世界动物卫生组织将EHD列为法定报告传染病。PCR(聚合酶链式反应)技术已广泛应用于动物疫病检测，该技术主要是基于病原微生物核酸的特异性，针对靶标设计特异性引物对DNA或RNA片段进行指数扩增。实时荧光PCR技术由传统PCR技术发展而来，实时荧光PCR在反应体系中加入标记荧光基团的探针，在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序来即时分析DNA或RNA样本的拷贝数。实时荧光PCR与传统PCR法相比，一方面加入的TaqMan探针在反应中只与模板的特异序列结合，不进行延伸，减少错配，提高检测准确性和特异性；另一方面实时荧光PCR在封闭的体系中进行扩增和实时检测，无需电泳就可以对结果进行分析，避免了传统PCR产物的污染，自动化程度高，重复性好，检测周期短，广泛应用于科研和临床检测。因此，应用荧光PCR技术建立鹿流行性出血病病毒检测方法对于快速、准确的检测鹿流行性出血病具有重要的意义。
技术实现思路
本技术目的在于提供一种鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该检测试剂盒能够快速、准确、有效地检测鹿流行性出血病病毒。本技术所提供的鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括盒体1、海绵垫2，所述海绵垫2上设有5×RT-PCR反应液容器孔3，内设有5×RT-PCR反应液；酶混合液容器孔4，内设酶混合液；正反向引物容器孔5，内设正反向引物；探针容器孔6，内设探针；阳性对照品孔7，内设阳性对照品；阴性对照品孔8，内设阴性对照品；无核酸酶水容器孔9，内设无核酸酶水。所述实时荧光RT-PCR正反向引物和探针分别为：正向引物：5’-CCTTTGTGGCATGGACTACGA-3’；反向引物：5’-AATGGGCGGTATATTGTTTGG-3’；探针：5’-FAM-CTGCGATTCTTAACA-TAMRA-3’。所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA，扩增目的片段长度为69bp。本检测试剂盒于-18℃以下保存。本技术试剂盒使用方法：每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。实时荧光RT-PCR 25μL反应体系：5×RT-PCR反应液5μL，正反向引物2μL，荧光探针1μL，模板5μL，用无核酸酶水补足25μL。阳性对照和阴性对照用量同模板为5μL。实时荧光PCR反应条件：50℃30分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；95℃3分钟，1个循环；95℃15秒→60℃1分钟，40个循环。本技术试剂盒质量控制：阴性对照无荧光对数增长，未检测到Ct值或相应的Ct值＞38.0；阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜35.0。上述条件有一条不满足时，实验视为无效。本技术试剂盒结果判断：Ct值＞38.00判定为阴性，Ct值≤35.00判定为阳性，Ct值在35.00～38.00则判为可疑，需重新检测，若仍为可疑，则可判为阳性。本技术鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒根据EHDV群特异性结构蛋白VP7基因cDNA为靶序列设计引物和探针，为鹿流行性出血病病毒检测提供一种特异性强，敏感性高，快速、准确的检测试剂盒。附图说明图1：本技术鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒结构示意图。图2：鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR敏感性测定扩增曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图对本技术做进一步详细、完整地说明，所举实例只用于解释本技术，并非用于限定本技术的范围。实施例1本技术试剂盒的结构如图1所示，包括盒体1、海绵垫2，所述海绵垫2上设有5×RT-PCR反应液容器孔3，内设有5×RT-PCR反应液；酶混合液容器孔4，内设酶混合液；正反向引物容器孔5，内设正反向引物；探针容器孔6，内设探针；阳性对照品孔7，内设阳性对照品；阴性对照品孔8，内设阴性对照品；无核酸酶水容器孔9，内设无核酸酶水。实时荧光RT-PCR正反向引物和探针分别为：正向引物：5’-CCTTTGTGGCATGGACTACGA-3’；反向引物：5’-AATGGGCGGTATATTGTTTGG-3’；探针：5’-FAM-CTGCGATTCTTAACA-TAMRA-3’。所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA，扩增目的片段长度为69bp。本检测试剂盒于-18℃以下保存。本技术试剂盒使用方法：每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。实时荧光RT-PCR 25μL反应体系：5×RT-PCR反应液5μL，正反向引物2μL，荧光探针1μL，模板5μL，用无核酸酶水补足25μL。阳性对照和阴性对照用量同模板为5μL。实时荧光PCR反应条件：50℃30分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；95℃3分钟，1个循环；95℃15秒→60℃1分钟，40个循环。质量控制要求：阴性对照无荧光对数增长，未检测到Ct值或相应的Ct值＞38.0；阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜35.0。上述条件有一条不满足时，实验视为无效。本技术试剂盒结果判断：Ct值＞38.00判定为阴性，Ct值≤35.00判定为阳性，Ct值在35.00～38.00则判为可疑，需重新检测，若仍为可疑，则可判为阳性。实施例2.：鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度测定。用质粒纯化试剂盒从宿主菌中提取携带EHDV-VP7基因的重组质粒pBAD-EHDV-VP7，用蛋白核酸测定仪测定提取的pBAD-EHDV-VP7的浓度，制备10×系列稀释(100～106)的模板，按照实施例1的方法进行实时荧光RT-PCR检测，从图2可知，8个稀释度均出现典型的扩增曲线，指数区明显，都检测到了Ct值，说明本技术试剂盒能检测到少至1个拷贝的模板，具有很高的灵敏度。实施例3：鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒特异性测定。采用鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒对EHDV-1、2、4、7型和蓝舌病病毒(BTV1-24型)、赤羽病病毒(AKV)、水泡性口炎病毒(VSV)细胞培养病毒进行检测，结果EHDV各血清型标准毒株均呈阳性扩增曲线，而BTV1-24型、AKV、VSV为阴性，结果见表1。说明本技术试剂盒可有效检出不同血清型EHDV，与亲缘关系最近的BTV无交叉反应，特异性好。表1实时荧光RT-PCR特异性测定病毒种类检测结果BTV1-24型阴性AKV阴性EHDV-1阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹿流行性出血病病毒实时荧光RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，包括盒体(1)、海绵垫(2)，所述海绵垫(2)上设有：5×RT‑PCR反应液容器孔(3)，内设5×RT‑PCR反应液；酶混合液容器孔(4)，内设酶混合液；正反向引物容器孔(5)，内设正反向引物；探针容器孔(6)，内设探针；阳性对照品孔(7)，内设阳性对照品；阴性对照品孔(8)，内设阴性对照品；无核酸酶水容器孔(9)，内设无核酸酶水。

【技术特征摘要】
1.一种鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括盒体(1)、海绵垫(2)，所述海绵垫(2)上设有：5×RT-PCR反应液容器孔(3)，内设5×RT-PCR反应液；酶混合液容器孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：林彦星，孙洁，祝贺，艾军，花群义，吕建强，杨俊兴，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：新型
国别省市：广东;44