对分泌性上皮和神经组织以及源自这些组织的肿瘤组织具有亲和力的抗体及其用途制造技术

技术编号:14077305 阅读:105 留言:0更新日期:2016-11-30 12:55
我们公开了细菌抗原以及获得的抗体的用途。所得到的抗体可用于通过免疫组织化学来诊断肿瘤,以及用于药物与抗体的结合以在癌症疗法中应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及细菌抗原的新用途以及根据该用途获得的抗体。所得到的抗体可用于通过免疫组织化学来诊断肿瘤,以及用于药物与抗体的结合以在癌症疗法中应用。脂多糖(LPS)是位于革兰氏阴性细菌细胞表面上的内毒素分子。其由毒性组分、脂A、核心区域以及对各血清型特异的O-多糖抗原组成[1]。大肠杆菌(Escherichia coli)的O24和O56血清型,特征在于在它们的脂多糖(lipopolisacharydach)中存在唾液酸。LPS中唾液酸的存在通过分子模拟机制(即,与宿主结构享有共同的表位)促成了细菌的致病性[2]。结构上类似于宿主抗原的细菌表位的存在(分子模拟现象),可以中断宿主的免疫应答。大肠杆菌O24和O56的脂多糖的O-特异性多糖具有类似的糖顺序,具有共同的结构→7)-α-NeuNAc-(2→3)-β-D-Glc(1→。分别通过O56多糖中的β-D-GlcpNAc和O24多糖中的β-D-GalpNAc使唾液酸糖基化[3]。基于存在与宿主结构一样的唾液酸表位的分子模拟,可以被以下的熟知实例支持:细菌聚唾液酸,与组织的聚唾液酸-糖缀合物(polisialyl-glycoconjugate)结构相同[4],或与和人红细胞区带3糖蛋白交叉反应的柠檬酸杆菌(Citrobacter)的O-特异性多糖O37结构相同[5]。特别重要的是,唾液酸在肿瘤细胞表面上的表达,表明与肿瘤表型(neoplasmic phenotype)的功能关系。转化进程和转移性伴有在肿瘤细胞表面上唾液酸的量、结合性和类型的变化[6]。特定癌症的特异识别仍是需要解决的问题。尤其期望的是,提供用于鉴定和区分分泌性上皮癌症和神经组织的新诊断工具。出人意料地证明了:本专利技术解决了上述问题。本专利技术的主题是对分泌性上皮和神经组织以及源自这些组织的肿瘤组织具有亲和力的抗体,所述抗体识别包含通过下式定义的结构基序的细菌抗原:本专利技术的另一目标是用于检测分泌性上皮细胞和神经组织以及源自这些组织的肿瘤组织细胞的诊断试剂盒,所述试剂盒包含如上定义的抗体。本专利技术的另一主题是由上式定义的抗原在产生对分泌性上皮和神经组织以及源自这些组织的肿瘤组织具有特异性的抗体中的用途。优选地,产生所述抗体以用于肿瘤的诊断。本专利技术的另一主题是制备对分泌性上皮和神经组织具有特异性的抗体的方法,其特征在于:用由上式定义的细菌抗原来对哺乳动物进行免疫,然后将识别所述抗原的抗体进行分离。优选地,在填装有载体的柱上利用亲和层析来分离所述抗体,所述载体含有由上式定义的固定化抗原。出人意料地,作为形成本专利技术的基础的研究结果,证明了:选择的人组织被抗-A24或抗-O56特异性地识别,尽管某些表位既被抗-A24识别又被抗-O56识别。而且,发现与抗-O56的优先反应性。许多测试的组织不与所述两种抗体中的任一种反应,证实了所观察现象的特异性。免疫组织化学的实验表明,针对大肠杆菌O24和O56的O-特异性多糖的抗体,识别人组织上的不同表位。出人意料的事实是,通过用大肠杆菌O24和O56的细菌细胞进行免疫之后获得的并且在固定化脂多糖的柱上进行纯化亲和层析的兔抗体,能识别组织结构。出人意料地我们注意到,这些抗菌抗体与肿瘤组织特别是癌症组织的高反应性,尤其对分泌性上皮和神经组织具有特异性。特别令人感兴趣的是已发现的反应性:抗-O24和抗-O56与一些结构的抗肿瘤反应性,这可用于癌症和肿瘤学的诊断。为了便于更好地理解本专利技术,通过附图和本专利技术的示例性实施方案的讨论来丰富上文的描述。附图说明图1.来自大肠杆菌O24和O56的O-特异性多糖的结构。图2.来自大肠杆菌血清型O24(1)和O56(2)的脂多糖的SDS-PAGE分析(A),以及利用亲和纯化的抗-大肠杆菌O24(B)和抗-大肠杆菌O56(C)的兔抗体进行的免疫印迹。图3.肝脏中的结肠转移性腺癌。用抗-O56在转移的分泌细胞中看到强阳性染色;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。图4.肝细胞癌(HCC)。HCC细胞显示与抗-分散的O56有强烈的反应;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。图5.胆管细胞癌(CCC)。CCC细胞显示与抗-O56抗体有非常强的分散的反应;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。图6.线状神经瘤(Coil neuroma)。显微照片中心的可见物是良性肿瘤的神经节细胞与抗-O56的适度阳性应答;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。图7.慢性肾移植排斥。肾小管细胞显示与抗-O56的强阳性染色;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。图8.神经线(Neural coils)。神经节细胞显示与抗-O56的适度阳性反应;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。图9.甲状腺。正常甲状腺中的甲状腺细胞(甲状腺上皮细胞)显示与抗-O56抗体的强烈反应;LSAB,用苏木精对比染色,100x放大倍数。实施例实施例1.本专利技术的抗体的制备细菌菌株和培养条件细菌菌株获自弗罗茨瓦夫波兰科学院免疫与实验疗法研究所的波兰菌种保藏中心。大肠杆菌O24(PCM 195)和O56(PCM 2372)与之前使用的相同[3]。在37℃通风的情况下,细菌在补充有酪蛋白水解产物和酵母提取物(Difco)的戴维斯营养肉汤中生长。24小时之后,收集细胞并冻干。利用苯酚-水通过萃取获得脂多糖,并通过超速离心进行纯化[7]。利用蛋白酶K方法进行LPS的分离和分析。对最初程序[8]略微改动如下。将磷酸盐缓冲液(PBS)中的细菌悬液调节至具有A600=0.3的均匀光学密度的浓度,然后将1.5ml的该材料离心(13 000g,4℃,15分钟)。将制成颗粒的细胞重悬在含有EDTA、甘油和SDS的200μl 10mM Tris-HCl缓冲液中,煮沸10分钟,并在60℃用蛋白酶K处理2小时。移除沉淀之后,在SDS的存在下,使溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后进行免疫印迹分析。血清的制备用悬浮在PBS中的冻干细菌对兔进行免疫,最初,皮下给予每1ml PBS中含100mg干燥细胞的剂量,然后一周两次静脉内(IV)给予增加的细菌量(100至6400mg/ml PBS)。末次免疫之后一周,使兔出血并分离血清,以及热灭活补体(56℃,30分钟),并储存于-20℃[9]。利用结合的脂多糖通过亲和层析纯化抗体。通过将大肠杆菌O24和O56的脂多糖(20mg)悬浮在2ml 2%SDS于200ml 0.5M EDTA的溶液中获得其可溶形式,然后用乙醇沉淀三次(1:4,v/v)并离心(每分钟12,000rpm,离心20分钟)。将LPS溶于水(1mL)中,超声处理并通过Dowex H+或Dowex Na+柱以获得制剂,分别是酸或钠盐制剂。从针对大肠杆菌O24和O56的兔血清(20ml)分离抗体,用硫酸铵盐析(9.6g(NH4)2SO4),4℃1小时,3000xg离心30分钟,25℃)之后,将其在PBS中稀释(1:2,v/v)。将沉淀的抗体溶于5ml PBS,并在4℃针对PBS进行透析。通过以下制备亲和柱:将酸形式的LPS与DMSO中的C18硅胶结合,用50%甲醇洗去未结合的LPS之后,在50%甲醇中装填进柱(1x10cm),用水和PBS洗涤,然后用含1%酪蛋白的PB本文档来自技高网...
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【技术保护点】
抗体,其对腺上皮、神经组织以及源自这些组织的肿瘤组织具有亲和力,其识别包含通过下式定义的结构基序的细菌抗原:

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.27 PL P.4066941.抗体,其对腺上皮、神经组织以及源自这些组织的肿瘤组织具有亲和力,其识别包含通过下式定义的结构基序的细菌抗原:2.诊断试剂盒,用于腺上皮细胞、神经组织或源自这些组织的肿瘤组织细胞的检测,其特征在于,其包含权利要求1所定义的抗体。3.由权利要求1定义的所述式1定义的所述抗原在产生对腺上皮和神经组织以及源自这些组...

【专利技术属性】
技术研发人员:艾格尼丝卡·寇兹尼奥斯卡科沃尔阿加塔·科赫曼皮奥特·齐奥尔科夫斯基安杰伊·加米安
申请(专利权)人:波兰科学院免疫和实验治疗研究所
类型:发明
国别省市:波兰;PL

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