一种成绿肉座菌的发酵生产方法及成绿肉座菌的固体培养基技术

本发明专利技术提供了一种成绿肉座菌的发酵生产方法，将成绿肉座菌菌种活化，在一级种子液体培养基和二级液体培养基进行培养以扩大繁殖，得到强健的菌体和一定量的孢子，将二级种子液接种到复合的碳源和氮源形成的固体培养基上，复合的碳源和氮源投入发酵生产，同时提供最适宜的非生物影响因子，有利于成绿肉座菌的快速生长和产孢，固体发酵后生成孢子含量在100亿个孢子/g。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一种成绿肉座菌的发酵生产方法及成绿肉座菌的固体培养基。
技术介绍
成绿肉座菌(Hypocrea virens)是一种抑制多种土传植物病原真菌的重寄生菌，菌落生长快，培养4天后直径7～9.5cm，气生菌丝卷毛状，白色或者灰色。分生孢子丰富，近于平展状覆盖于平板。成绿肉座菌作为植物病害生物防治的主要机制，已经越来越受到各国植物病理学家的重视。重寄生菌作为生物防治的重要因子，对于防治植物病害具有重要作用。现有技术中，关于成绿肉座菌发酵工艺的报道较少，仅专利号为CN10375911A的专利技术专利记载了关于成绿肉座菌的发现和应用的相关内容，成绿肉座菌培养方法和培养基仅是对成绿肉座菌的活化培养及活化培养基两方面有记载，并未就成绿肉座菌发酵方法以及发酵各阶段所使用的培养基有记载。成绿肉座菌活化培养方法无法满足本领域预防植物病害的应用，而传统的真菌发酵方法能够实现工业化生产，但存在发酵时间长，成本高，收率低等问题，不能满足现有防止植物病害的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于得到优化的发酵生产方法，能够得到一种更高效的控制手段，最终获取孢子含量较高的绿肉座菌孢子粉。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种成绿肉座菌的发酵生产方法，包括下列步骤：1)将成绿肉座菌菌种活化，接种到一级液体培养基中培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液与固体培养基混合后形成菌料，培养后，得到成绿肉座菌孢子；所述固体培养基包括下列质量百分含量组分，麦麸65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷壳7.80％～13.40％。优选的，所述步骤1)中培养的时间为35～50h，培养的温度为25～30℃，光照培养的强度为2000～3000lx。优选的，所述步骤1)中的培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/20min，每次搅拌的时间为1～2min，搅拌频率为150～300r/min；所述培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入培养24h内，通气量为10～15m3/h，培养24h后，通气量15～24m3/h；所述培养的接种量为1～5％；所述一级种子液培养基的初始pH值为5.5～6.5。优选的，所述步骤2)中发酵培养的时间为55～70h，培养温度为28～32℃，光照培养的强度为3000～4000lx；优选的，所述步骤2)中发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：接种到固体培养后24h之内，通气量为100～180m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h。优选的，所述步骤2)中的培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/20min，每次搅拌的时间为1～2min，搅拌频率为150～300r/min。优选的，所述步骤2)中培养的接种量为8～15％。优选的，所述培养发酵过程控制二级液体培养基的pH值为5.5～6.5。优选的，所述步骤3)固体培养的接种量为12～20％。优选的，所述步骤3)固体培养基的厚度为2.5～3.5cm。优选的，所述步骤3)固体培养过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为85～90％，环境温度为25～26℃，菌料温度控制为28～30℃，在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为40～60％，环境温度为30℃，6～7d之内环境温度为30～35℃；所述固体培养32～36h时翻盘散热；所述固体培养48～55h时将营养液喷洒到菌料上；光照培养的强度为2000～3000lx。优选的，所述营养液包括质量浓度为3～6％葡萄糖和质量分数为0.0005～0.002％的ZnCl2；优选的，所述营养液的喷洒量为菌料质量的5～10％。优选的，所述一级种子液体培养基包括下列质量百分含量的组分：葡萄糖0.50％～2.00％、白砂糖0.50％～2.00％、黄豆粉0.10％～0.30％、硫酸铵0.10％～0.30％、磷酸氢二钾0.05％～0.10％、氯化钾0.05％～0.10％、硫酸镁0.01％～0.04％、硫酸铁0.00％～0.004％，余量为水；更优选的，所述一级种子液体培养基包括下列百分含量组分，葡萄糖1％、白砂糖1％、黄豆粉1％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、氯化钾0.08％、硫酸镁0.02％、硫酸铁0.0002％，余量为水。优选的，所述的二级种子液体培养基包括下列质量百分含量组分，葡萄糖1％～3％、白砂糖1％～3％、马铃薯粉0.5％～1.5％、黄豆粉0.5％～1.5％、玉米粉0.3％～1.0％、磷酸氢二钾0.01％～0.02％，余量为水；更优选的，所述的二级种子液体培养基包括下列百分含量组分，葡萄糖2％、白砂糖2％、马铃薯粉1％、黄豆粉1％、玉米粉0.5％、磷酸氢二钾0.01％，余量为水。本专利技术还提供了一种成绿肉座菌的固体培养基，包括下列质量百分含量组分，麦麸65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷壳7.80％～13.40％，余量为水。优选的，所述的固体培养基包括下列质量百分含量组分，麦麸70％、豆粕10％、玉米粉10％、谷壳10％。本专利技术提供了一种成绿肉座菌的发酵生产方法，将成绿肉座菌菌种活化，在一级种子液体培养基和二级液体培养基进行培养以扩大繁殖，得到强健的菌体和一定量的孢子，将二级种子液接种到复合的碳源和氮源形成的固体培养基上，使成绿肉座菌的快速生长和产孢。将固体发酵得到的成绿肉座菌培养物进行检测，产孢子量为80～120亿个孢子/g，由此可见，采用本专利技术的技术方案最终获取孢子含量较高的绿肉座菌孢子粉，解决了本专利技术的技术问题。进一步的，本专利技术通过温度与湿度梯度化管理来完成产孢和收集孢子，在刚进行固体培养时，给予高温高湿的环境，让菌丝在固体培养基中迅速适应环境；在密集发酵期即进入发酵第20h～40h时为应对物料温度将会急速的升高降低环境温度，防止烧盘，同时在30h左右将发酵料翻动，以便于扇热的同时为菌种更好的提供空气；在产孢阶段，降低房间湿度和温度，有利于促进菌丝产生孢子；控制在菌丝颜色有变化之时，在50h左右菌丝颜色发生变化时补液能够给菌丝充足的葡萄糖和无机盐以促进产孢子。保藏说明成绿肉座菌(Hypocrea virens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所，保藏日期为2013年08月13日，其保藏编号为CGMCC No.7995。具体实施方式本专利技术提供了本专利技术提供了一种成绿肉座菌的发酵生产方法，包括下列步骤：1)将成绿肉座菌菌种活化，接种到一级种子液体培养基中培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液与固体培养基混合培养，得到成绿肉座菌孢子；所述固体培养基包括下列质量百分含量组分，麦麸65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成绿肉座菌的发酵生产方法，其特征在于，包括下列步骤：1)将成绿肉座菌菌种活化，接种到一级液体培养基中培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液与固体培养基混合形成菌料，进行固体培养后，得到成绿肉座菌孢子；所述固体培养基包括下列质量百分含量组分，麦麸65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷壳7.80％～13.40％。

【技术特征摘要】
1.一种成绿肉座菌的发酵生产方法，其特征在于，包括下列步骤：1)将成绿肉座菌菌种活化，接种到一级液体培养基中培养，得到一级种子液；2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行发酵培养，得到二级种子液；3)将所述步骤2)得到的二级种子液与固体培养基混合形成菌料，进行固体培养后，得到成绿肉座菌孢子；所述固体培养基包括下列质量百分含量组分，麦麸65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷壳7.80％～13.40％。2.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤1)中培养的时间为35～50h，培养的温度为25～30℃，光照培养的强度为2000～3000lx；所述步骤1)中培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入培养24h内，通气量为10～15m3/h，培养24h后，通气量15～24m3/h；所述步骤1)中培养的接种量为1～5％；所述步骤1)中培养的初始pH值为5.5～6.5。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中发酵培养的时间为55～70h，培养温度为28～32℃，光照培养的强度为3000～4000lx；所述步骤1)和步骤2)中的培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/20min，每次搅拌的时间为1～2min，搅拌频率为150～300r/min；所述步骤2)中发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：接种到二级液体培养基后24h之内，通气量为100～180m3/h，发酵培养24h后，通气量为200～260m3/h；所述步骤2)发酵培养的接种量为8～15％；所述培养发酵过程控制二级液体培养基的pH值为5.5～6.5。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)固体培养的接种量为12～20％；所述步骤3)所述固体培养基的厚度为2.5～3.5cm；所述步骤3)固体培养过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗建辉，石仕福，李英武，梁小文，王根豪，严艺波，李肖宇，吴俊杰，石峥，曾升华，罗双燕，
申请(专利权)人：江西天人生态股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36