抗凝血酶活性检测试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了抗凝血酶活性检测试剂，包括试剂1和试剂2，其中：试剂1为FXa的发色底物，试剂2为含有FXa和肝素的稀释液；其中FXa的发色底物选自以下：CH3SO2‑D‑Leu‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·AcOH；CH3OCO‑D‑CHG‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·AcOH；CH 3OCO‑D‑CHA‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·AcOH；Benzoyl‑Ile‑Glu‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·HCl；Suc‑Ile‑Glu(γ‑Piperidyl)‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·HCl；N‑α‑Z‑D‑Arg‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·2HCl；Boc‑D‑Arg‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·2HCl；Acetyl‑D‑Arg‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·2HCl；4‑Nz‑D‑Arg‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·2HCl；4‑Mbs‑D‑Arg‑Gly‑Arg‑p‑nitroanilide·2HCl。本发明专利技术检测稳定性和重复性好，具有很高的灵敏度和准确度，能准确反应抗凝血酶的活性，并找到体内抗凝血酶活性异常的患者，从而为治疗提供依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学检测
，涉及一种抗凝血酶活性检测试剂及其制备方法和应用。
技术介绍
一、人体的止血(凝血)机制止血(凝血)机制是人体的一项非常重要的自我保护功能，止血(凝血)机制包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键，它能在血管受伤破损时通过血小板的凝聚来封闭血管的伤口从而防止大量的血液流失。止血(凝血)过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程，止血(凝血)过程最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。尤其止血(凝血)过程是一个被精准调控的过程，血小板的凝聚既要有一定的量来保证封闭住血管的伤口又不能凝聚过多反而堵塞血管。机体的正常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能、有效的血小板质量和数量，以及正常的血浆凝血因子活性。这样一个复杂的精准调控的过程分为：初期止血、二期止血、三期止血，是由血小板、血管壁和一系列凝血因子和纤维蛋白溶解因子共同参与和相互作用完成的。初期止血涉及受损血管的收缩、内皮下胶原组织的暴露以及血小板在受损血管表面的粘附、聚集和形成初期止血栓。由于它们在强度上还不足以抵抗血液在血管中流动所产生的剪切力带来的冲击，故人体止血(凝血)机制还需要纤维蛋白凝聚物的进一步结合作用和稳定作用才能够完成封闭住血管的伤口的任务。二期止血是指在形成初期止血栓的部位进一步形成纤维蛋白凝块的过程。纤维蛋白凝聚物的产生是一个复杂的过程。血管壁受伤破损导致一系列凝血因子的活化，通过凝血瀑布的传递活化了因子(即凝血因子)X，活化因子X(以下简称FXa)进一步把凝血酶原活化为凝血酶。凝血酶是一种多功能的蛋白酶，它在止血过程中非常关键，是一个处于核心地位的凝血因子。它把纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白随后多聚体化形成纤维蛋白凝聚物。纤维蛋白凝聚物通过和血小板凝聚物细胞膜表面上蛋白的进一步作用来稳定它们增加它们的强度。这样才能封闭住血管的伤口防止血液更多流失。当血管的伤口愈合修复时，血液中的纤维蛋白溶解过程启动来除去这些纤维蛋白凝聚物避免血管堵塞以及其它的危害。三期止血是由血小板聚合物、纤维蛋白丝和陷入的红细胞所组成的疏松的网状物，通过此过程形成了牢固的凝血块。在正常情况下，血管没有受伤时，血液系统中有一些机制来防止止血过程非正常启动从而引起纤维蛋白凝聚物形成甚至血栓。抗凝血酶(又称抗凝血酶III，英文缩写为ATIII)就是其中重要的一个。二、血液中抗凝血酶测定的临床意义抗凝血酶能抑制凝血酶以及其它一些凝血瀑布中的丝氨酸蛋白酶比如活化因子X(FXa)，活化因子IX(FIXa)和活化因子XI(FXIa)，这些蛋白酶的活性位点和抗凝血酶的反应中心会形成复合物从而这些蛋白酶的活性受到抑制。但是抗凝血酶抑制这些蛋白酶的效率并不高，而当人体内的一些葡萄糖胺聚糖，比如硫酸类肝素在血管壁和抗凝血酶结合时，则会引起抗凝血酶的构象变化导致抗凝血酶抑制这些蛋白酶的效率增加千倍左右。医疗上应用的肝素提取自牛或猪的肠，它被广泛的用作抗凝剂。它和抗凝血酶结合，具有和硫酸类肝素类似的作用，也会极大的增加抗凝血酶抑制这些蛋白酶的效率。抗凝血酶在防止止血机制过度使用和血栓形成上有重要作用，且抗凝血酶缺失会导致静脉血栓或者肺栓塞症，而抗凝血酶含量或者活性低的个体患上易栓症和形成血栓的危险性也比较高。抗凝血酶缺失有遗传性的也有获得性的：遗传性抗凝血酶缺失症在1965年在一个经常发生血栓性栓塞的挪威家庭发现。正常人的抗凝血酶的活性被定义为100％，通常75％-125％是正常范围，而这类患者的抗凝血酶活性只有正常人的40-70％。获得性抗凝血酶缺失症的原因有多种，包括肝病引起的抗凝血酶合成减少，肾病引起的抗凝血酶流失，使用肝素等药物引起的抗凝血酶损失，以及弥散性血管内凝血引起的抗凝血酶消耗。抗凝血酶缺失症的治疗包括使用肝素、华伐令或者纯化抗凝血酶。无论是遗传性的还是获得性的抗凝血酶缺失症都给患者带来血栓的风险，给他们的健康和生命带来难以预测的威胁。而对抗凝血酶的准确检测则会对抗凝血酶缺失症、易栓症、静脉血栓以及肺栓塞症的及时的诊断和治疗具有重大的意义。三、抗凝血酶测定的影响因素据了解，现有的公开的对抗凝血酶的检测大致有三类方法，分别是凝固法、免疫法和以凝血酶为基础的发色底物法。凝固法主要是比较待测血浆和参考血浆在凝血瀑布被相应试剂激活后凝固时间来测定抗凝血酶的活性。虽然凝固法可以直接使用待测血浆也可以将待测血浆加热脱纤维蛋白然后使用，但其操作繁琐而且凝固时间变异较大，不利于准确测算。免疫类方法分为两种，第一种是酶联免疫法。这种方法是在微量滴定板的孔中包被上抗凝血酶的抗体，然后加入不同比例稀释的样本血浆和标准血浆孵育，清洗之后加入辣根过氧化物酶标记的抗抗凝血酶的抗体，再次清洗之后加入辣根过氧化物酶的底物，反应完全后读取吸光度，最后通过标准血浆的吸光度得到标准曲线再推算出标准血浆的抗凝血酶含量。免疫类方法中的另一种方法称为劳瑞尔火箭电泳法，是将抗抗凝血酶的抗体和融化的琼脂混合然后冷却成胶，加上样本血浆和标准血浆后进行电泳，电泳完成后抗原抗体复合物用考马斯蓝染色来检测。不同抗凝血酶含量的血浆形成的抗原抗体复合物具有不同的高度，而其含量和浓度是成正比的。据此可以得出标准曲线和样本血浆中抗凝血酶的含量。；由于上述免疫类方法是手工操作，故不同检测批次间的差异较大，步骤繁琐，准确度不高，且不能进行自动化操作。第三类方法是以凝血酶为基础的发色底物法。此法是在待测血浆中加入肝素以及过量的凝血酶进行孵育，试剂中的凝血酶在肝素的存在下与待测血浆中的抗凝血酶形成凝血酶和抗凝血酶的复合物，使凝血酶的活性受到抑制。此后再加入凝血酶的发色底物进行孵育，这里的发色底物是由三到四个氨基酸和共价结合在末端的4-硝基苯胺(4-nitroaniline，pNA)组成，其可以被剩余的未被抑制的凝血酶裂解并释放出4-硝基苯胺，这种反应可引起在405纳米处吸光度的变化，而产生的4-硝基苯胺的量是和样品中抗凝血酶的活性成反比的。因此，利用测量405nm处吸光度的变化就可以制作标准曲线并推算出样品中抗凝血酶的活性。由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短，能够适用于多种自动化分析仪器，且在国产化检测试剂的发展下，大幅降低了临床检测费用，在临床应用中应用也越加广泛。实际上，虽然此法已在临床应用中广泛使用，但在其测定过程中大多还是有检测结果受血浆中多种干扰物质影响的情况发生。例如，采用以凝血酶为基础的发色底物法测定抗凝血酶活性，如果样品中含有凝血酶抑制剂(如水蛭素、阿加曲班等)，将会使检测结果偏高；又如血液中自然存在的肝素辅因子II和肝素结合，可以抑制凝血酶活性，使此法测定抗凝血酶受到肝素辅因子II的影响从而高估样品中抗凝血酶的活性。因此，此法的使用范围受到了一定的限制。四、现有技术的局限性为了降低肝素辅因子II的影响，美国专利US5985582和中国专利CN102690862A中，公开了一种抗凝血酶III测定试剂盒(ATIII发色底物法)，是以凝血酶为基础的发色底物法进行测定，试剂盒包含肝素衍生物、凝血酶和发色底物试剂；所述试剂在把肝素加入样本前将其进行酶解，裂解出一个或多个不饱和双糖而得到肝素衍生物。这种肝素衍生物仍然具有与肝素类似的本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗凝血酶活性检测试剂，包括试剂1和试剂2，其特征在于：试剂1为FXa的发色底物，试剂2为含有FXa和肝素的稀释液。

【技术特征摘要】
2015.12.04 CN 20151088401341.抗凝血酶活性检测试剂，包括试剂1和试剂2，其特征在于：试剂1为FXa的发色底物，试剂2为含有FXa和肝素的稀释液。2.抗凝血酶活性检测试剂，包括试剂1、试剂4和试剂3，其特征在于：试剂1为FXa的发色底物，试剂4为FXa，试剂3为含有肝素的稀释液。3.根据权利要求1或2所述的抗凝血酶活性检测试剂，其特征在于：所述FXa的发色底物选自以下底物中的任一一种：CH3SO2-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH；CH3OCO-D-CHG-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH；CH 3OCO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH；Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl；Suc-Ile-Glu(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl；N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；Boc-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；4-Mbs-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2H...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵铁铭，
申请(专利权)人：上海贞元诊断用品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31