本发明专利技术公开了一种分离纯化单克隆抗体的方法，该方法包括：将包含单克隆抗体的细胞培养上清液进行Protein A亲和层析，以便获得第一洗脱组分；将该第一洗脱组分保持特定pH值状态下室温放置特定时间，以便获得经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分；将经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和后进行阳离子交换层析，以便获得第二洗脱组分；将该第二洗脱组分稀释后进行阴离子交换层析，以便获得流穿；利用除病毒过滤器，将该流穿进行过滤，以便获得滤液；以及将该滤液依次进行超滤浓缩和洗滤更换缓冲液，以便得到该单克隆抗体的原液。该方法简单易行，所得产品内毒素含量及其它各项质量指标均符合单克隆抗体药物的质量标准。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药
，特别涉及抗体药物开发和生产领域，具体而言，涉及一种分离纯化重组抗人-EGFR单克隆抗体的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致的死亡中紧跟心脏病之后位居第二位。随着人口老龄化和城市化进程的不断发展，恶性肿瘤的发病率呈明显上升趋势。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因C-erbB-1的表达产物，erbB-1广泛分布于除血管组织外的上皮细胞膜上。目前在多种实体瘤如结直肠癌、头颈癌、肺癌中均发现EGFR的过渡表达。EGFR是一种跨膜糖蛋白，分子量约为170KD，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组分：胞外区由氨基端的621个氨基酸构成，是配体结合区；跨膜区是由23个氨基酸残基螺旋构成的疏水区；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。EGFR的信号传导途径是癌症发生发展的重要影响因素，在肿瘤细胞的增值、损失修复、侵袭及新生血管形成等方面起着重要作用。大量研究证明，EGFR可以作为肿瘤治疗的一个有效靶点。靶向EGFR的药物主要有两类：一类是作用于受体胞内区的小分子酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼等；另一类是作用于受体胞外区的单克隆抗体，如西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等。分离纯化工艺的开发是抗体药物开发的核心，是决定产品的安全、有效、收率和成本的技术基础。然而，目前的重组抗人-EGFR单克隆抗体的分离纯化方法，仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前文献报道的制备重组抗人-EGFR单克隆抗体的方法主要集中在上游方面，关于下游分离纯化工艺报道的较少，并且目前的重组抗人-EGFR单克隆抗体的纯化工艺，是将细胞上清液依次经过亲和层析、低pH值灭活病毒、阴离子交换层析、除病毒过滤、切向流膜包洗滤更换缓冲液、阳离子交换层析、切向流膜包洗滤更换缓冲液及超滤浓缩、无菌过滤等步骤实现，该工艺存在所得产品的内毒素不合格的风险，且阳离子交换层析纯化步骤前后均需要用切向流膜包洗滤更换缓冲液，过程较繁琐，在工业生产中延长了时间和增加了成本。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种在重组抗人-EGFR单克隆抗体制备工艺中，高效分离纯化制备的重组抗人-EGFR单克隆抗体的手段。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种分离纯化单克隆抗体的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：将包含单克隆抗体的细胞培养上清液进行Protein A亲和层析，以便获得第一洗脱组分；将所述第一洗脱组分保持特定pH值状态下室温放置特定时间，以便获得经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分；将经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和后进行阳离子交换层析，以便获得第二洗脱组分；将所述第二洗脱组分稀释后进行阴离子交换层析，以便获得流穿；利用除病毒过滤器，将所述流穿进行过滤，以便获得滤液；以及将所述滤液依次进行超滤浓缩和洗滤更换缓冲液，以便得到所述单克隆抗体的原液。专利技术人惊奇地发现，本专利技术的分离纯化单克隆抗体的方法简单易行，所得产品内毒素含量及其它各项质量指标均符合单克隆抗体药物的质量标准。具体地，本专利技术的方法创造性地将阴离子交换层析步骤置于阳离子交换层析步骤之后，由此，既能通过阴离子交换层析有效去除内毒素，使得内毒素更容易控制，而且经过阳离子交换层析获得的第二洗脱组分通过简单的稀释即可直接上样于阴离子层析柱，省去了切向流膜包洗滤更换缓冲液步骤，节省了时间和成本。另外，根据本专利技术上述实施例的分离纯化单克隆抗体的方法还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述单克隆抗体为选自重组抗人-EGFR单克隆抗体、重组抗人TNF-α单克隆抗体、重组抗人CD-20单克隆抗体、重组抗人HER-2单克隆抗体和重组抗人-VEGF单克隆抗体的至少一种。根据本专利技术的实施例，所述Protein A亲和层析进一步包括：将所述包含单克隆抗体的细胞培养上清液上样于平衡后的protein A亲和层析柱中，然后依次进行缓冲液A洗涤、缓冲液B冲洗、缓冲液A洗涤和缓冲液C洗脱，以便得到所述第一洗脱组分，其中，缓冲液A为含100-200mM NaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液B为含0.5-1.5M NaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液C为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或甘氨酸盐缓冲液。由此，捕获纯化效率高。根据本专利技术的一些具体示例，所述缓冲液A包含20mM磷酸盐缓冲液和100-200mM NaCl，pH值为7.0-7.5；所述缓冲液B包含20mM磷酸盐缓冲液和0.5-1.5M NaCl，pH值为5.5-7.0；所述缓冲液C为0.05-0.15M的醋酸盐缓冲液或甘氨酸盐缓冲液，pH值为3.0-3.5。由此，洗脱效果好。根据本专利技术的实施例，Protein A亲和层析所采用的层析填料不受特别限制，只要能够有效捕获目标抗体，实现纯化的目的即可。根据本专利技术的一些实施例，可以利用选自Mabselect SuRe、Mabselect SuRe LX、ProSep Ultra Plus和POROS MabCapture A层析填料的至少一种进行所述Protein A亲和层析。由此，纯化效果好，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，将所述第一洗脱组分保持pH值为3.2-3.7状态下室温放置0.5-4
小时。由此，可以有效灭活病毒。根据本专利技术的实施例，所述阳离子交换层析进一步包括：将所述经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分进行中和，然后上样于平衡后的阳离子交换层析柱中，再依次进行缓冲液D洗涤和缓冲液E洗脱，以便得到所述第二洗脱组分，其中，所述缓冲液D包含20mM磷酸盐缓冲液和0-50mM NaCl、pH值为5.8-6.4，缓冲液E包含20mM磷酸盐缓冲液和100-200mM NaCl、pH值为5.8-6.4。由此，纯化效果好，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，将所述经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和至pH值为5.0-5.8后进行所述阳离子交换层析。由此，可将单克隆抗体有效的结合于阳离子交换层析柱上。根据本专利技术的实施例，利用pH值为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，将所述经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分进行中和。根据本专利技术的实施例，所述阳离子交换层析采用的层析填料不受特别限制，只要能够有效实现纯化目标抗体的目的即可。根据本专利技术的一些实施例，利用选自Capto SP ImpRes、POROS XS和Eshmuno CPX层析填料的至少一种进行所述阳离子交换层析。由此，纯化效果好。根据本专利技术的实施例，所述阴离子交换层析进一步包括：将所述第二洗脱组分稀释后上样于平衡后的阴离子交换层析柱中，收集流穿。根据本专利技术的实施例，利用pH值为6.0-7.0的15-25mM的磷酸盐缓冲液，将所述第二洗脱组分进行2-5倍稀释。由此可以降低第二洗脱组分的盐浓度并使其pH值与阴离子交换层析所使用的平衡缓冲液pH值相近，有利于目标抗体流穿，而内毒素、宿主DNA、宿主蛋白等杂质结合与阴离子交换层析填料，实现有效纯化目标抗体。根据本专利技术的实施例，所述阴离子交换层析采用的层析填料不受特别限制，只要能够有效实现纯化目标抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离纯化单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含单克隆抗体的细胞培养上清液进行Protein A亲和层析，以便获得第一洗脱组分；将所述第一洗脱组分保持特定pH值状态下室温放置特定时间，以便获得经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分；将经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和后进行阳离子交换层析，以便获得第二洗脱组分；将所述第二洗脱组分稀释后进行阴离子交换层析，以便获得流穿；利用除病毒过滤器，将所述流穿进行过滤，以便获得滤液；以及将所述滤液依次进行超滤浓缩和洗滤更换缓冲液，以便得到所述单克隆抗体的原液。
【技术特征摘要】
1.一种分离纯化单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含单克隆抗体的细胞培养上清液进行Protein A亲和层析，以便获得第一洗脱组分；将所述第一洗脱组分保持特定pH值状态下室温放置特定时间，以便获得经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分；将经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和后进行阳离子交换层析，以便获得第二洗脱组分；将所述第二洗脱组分稀释后进行阴离子交换层析，以便获得流穿；利用除病毒过滤器，将所述流穿进行过滤，以便获得滤液；以及将所述滤液依次进行超滤浓缩和洗滤更换缓冲液，以便得到所述单克隆抗体的原液。2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体为选自重组抗人-EGFR单克隆抗体、重组抗人TNF-α单克隆抗体、重组抗人CD-20单克隆抗体、重组抗人HER-2单克隆抗体和重组抗人-VEGF单克隆抗体的至少一种。3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述Protein A亲和层析进一步包括：将所述包含单克隆抗体的细胞培养上清液上样于平衡后的protein A亲和层析柱中，然后依次进行缓冲液A洗涤、缓冲液B冲洗、缓冲液A洗涤和缓冲液C洗脱，以便得到所述第一洗脱组分，其中，缓冲液A为含100-200mM NaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液B为含0.5-1.5M NaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液C为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或甘氨酸盐缓冲液，优选地，所述缓冲液A包含20mM磷酸盐缓冲液和100-200mM NaCl，pH值为7.0-7.5；所述缓冲液B包含20mM磷酸盐缓冲液和0.5-1.5M NaCl，pH值为5.5-7.0；所述缓冲液C为0.05-0.15M的醋酸盐缓冲液或甘氨酸盐缓冲液，pH值为3.0-3.5。4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，利用选自Mabselect SuRe、Mabselect SuRe LX、ProSep Ultr...
【专利技术属性】
技术研发人员：王学海，陈爱芳，何昆，许勇，杨仲文，李莉娥，马梵辛，张帆，吕兴凯，田吕明，肖强，黄璐，田华，于静，
申请(专利权)人：湖北生物医药产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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