本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备方法以及果蔬防腐方法，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Cy‑29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。所述生物防腐剂包括上述的枯草芽孢杆菌Cy‑29，所述果蔬防腐方法包括使用上述枯草芽孢杆菌Cy‑29的发酵产物的方法。本发明专利技术通过枯草芽孢杆菌Cy‑29的定植，生长和/或其产生的抑菌物质的拮抗作用有效抑制果实的呼吸作用，明显降低果实冷藏期间的腐烂率且多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备方法以及果蔬防腐方法。
技术介绍
农业生产中，植物病害是导致作物产量损失和品质下降的主要原因之一，其中大部分由真菌引起。据报道，发达国家每年有10％-30％的新鲜水果损失于采后腐烂，而在缺乏冷藏贮运设施的发展中国家，果实腐烂率则超过40％，而引起果实腐烂的大多为真菌。在实际生产过程中，植物病害防治主要依赖于化学农药，化学农药在保护农业生产方面起到重大作用。但其长期普遍使用会导致病原菌产生抗药性、产品农药残留超标、环境污染等系列问题，同时也使本身具有优良品质的农产品因农药的过渡而受影响。所以，保证农产品优质高产、保护生态环境的病害防治技术的研究势在必行。而生物防治，作为有望代替化学药剂的一种安全、高效的新方法成为当前的研究热点。目前植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等很多生物群类，其中枯草芽孢杆菌在生物防治中应用较为广泛。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜热、好氧、产芽孢的G+杆状细菌。对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。在自然界中分布广泛，不仅可以在土壤、植物根际、体表等外界环境中生长，还是植物体内常见的内生细菌。其突出特点是生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，且批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前国内外已有关于芽孢杆菌作为生防菌应用于多种植物生长病害和贮藏病害防治中的研究报道。例如申请公布号为CN101870959A的专利技术专利公开了一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用，涉及的枯草芽孢杆菌命名为Bacillussubstilis J18，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏 号为CGMCC No：3665，菌株经过发酵培养后，制成发酵剂，发酵剂分别与氯化钙和壳聚糖溶液混合制成干粉剂和被膜剂，其对梨采后黑斑病同时对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等都有显著的防治效果。但其仅对梨采后病原菌一黑斑病有显著拮抗效果，并不具有对其他易腐烂水果产生有效防腐的作用效果，并且其具有广谱性不佳的缺点，同时该菌株对果蔬所产生的呼吸抑制效果不明显，进一步降低了防腐效果。由此可见，能否基于现有技术中的不足，筛选出一种具有高效广谱性、防腐效果好，同时能够有效的抑制采摘后果蔬的呼吸作用，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种来源于土壤的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，最初来源于果园的土壤样本，样本经过梯度稀释，分离纯化之后得到对植物病原真菌有抑制作用的菌株，并对菌株进行鉴定，最终得到的菌株具有高效广谱性，防腐效果好，同时能够有效抑制采摘后果蔬的呼吸作用。为了达到上述技术效果，本专利技术包括以下技术方案：一种枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。本专利技术在土壤中提取并筛选出一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，最初来源于果园的土壤样本，样本经过梯度稀释，分离纯化之后得到对植物病原真菌有抑制作用的菌株，并对菌株进行鉴定得到。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29及其发酵产生的抑菌物质具有较强的广谱抗真菌作用，对于多种植物生长病原真菌和果蔬贮藏真菌有较好的抑制作用，为植物生长病害和果蔬贮藏病害的生物防治提供了依据。枯草芽孢杆菌Cy-29发酵所产生的抑菌物质具有以下性质：耐热性良好，能耐受121℃的高温；在pH在3-10内能保持较高的活性，作用范围较广；短时间紫外线照射对其影响较小；经木瓜蛋白酶处理后仍有部分活性。进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的细胞呈短杆状， 革兰氏染色为阳性，存在芽孢。在营养琼脂培养基上，菌落表明粗糙，低凸起，边缘不规则，无光泽不透明。进一步的，所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列长1589bp，其序列如SEQ ID No.1所示。同源比对结果表明：该序列与序列号为序号为FR729926的枯草芽孢杆菌ZWQ-1的16S rDNA序列同源性最高，相似性为99％，结合菌体形态特征，生理生化鉴定结果确定Cy-29属于芽孢杆菌(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。一种上述枯草芽孢杆菌在制备植物生长抗菌剂或果蔬防腐剂中的应用。一种上述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。进一步的，所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，将指状青霉孢子悬液加入PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板中；所述牛肉膏蛋白胨培养平板中的牛肉膏蛋白胨培养基的制备方法包括以下步骤：取以下重量份数1～10份的牛肉膏、5～20份的蛋白胨和3～15份的NaCl作为原料组分，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0～7.2，灭菌处理得到牛肉膏蛋白胨培养基；所述PDA固体培养基的制备方法包括以下步骤：取重量份数为100～400份的马铃薯、10～35份的葡萄糖和10～25份的琼脂粉，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0～7.2，灭菌处理得到PDA固体培养基。上述的牛肉膏蛋白胨培养基和PDA固体培养基配方成分设计合理，且该配方成分的培养基能够筛选得到本专利技术所述的枯草芽孢杆菌Cy-29。一种生物防腐剂，包括上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的发酵产物。本专利技术的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29产生的发酵产物，其对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，有效抑制果实的呼吸作用，明显降低 果实冷藏期间的腐烂率。进一步的，所述的发酵产物为菌悬液和/或发酵上清液，所述菌悬液的菌体浓度为107CFU/mL。优选地，所述的菌悬液为对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液，所述发酵上清液为稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液。一种上述的生物防腐剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：枯草芽孢杆菌Cy-29的活化：取枯草芽孢杆菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，置于培养箱中培养，挑取单菌落再次在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，继续置于培养箱中培养得到活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落；步骤二：枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的制备：取活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养制得种子液，将所述种子液接种于LNB培养基中，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物。进一步的，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy‑29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的细胞呈短杆状，革兰氏染色为阳性，存在芽孢；所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列长1589bp，其序列如SEQ ID No.1所示。3.一种权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌在制备植物生长抗菌剂或果蔬防腐剂中的应用。4.一种权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，将指状青霉孢子悬液加入PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板中。6.一种生物防腐剂，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacill...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡欣洁，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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