灵芝羊毛甾醇衍生物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术从多孔菌科灵芝中分离得到4个羊毛甾醇衍生物，经鉴定，均为具有新颖结构的三萜化合物；运用体外抗肿瘤细胞增殖筛选体系进行活性评价，发现本发明专利技术所述灵芝羊毛甾醇衍生物能有效地抑制人乳腺癌细胞株(MDA‑MB‑231)和人肝癌细胞(HepG2)的增殖，表明本发明专利技术灵芝羊毛甾醇衍生物具有预防和治疗肿瘤的作用，可以在制备抗肿瘤药物中应用。

Ganoderma lucidum sterol derivative, preparation method and application thereof

The present invention from Polyporaceae Ganoderma lucidum isolated 4 lanosterol derivatives were identified, with three triterpenoids, novel structure; activity evaluation using in vitro antiproliferative screening system, found that the ganoderma lanosterol derivatives can effectively inhibit human breast cancer cell line (MDA MB 231) and human hepatocellular carcinoma cell (HepG2) proliferation, show that the invention of Ganoderma lucidum lanosterol derivatives with cancer prevention and treatment effect, can be used in the preparation of antitumor drugs.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种羊毛甾醇衍生物及其制备方法和用途，具体设计一种灵芝羊毛甾醇衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，属于天然产物化学领域。
技术介绍
恶性肿瘤(癌症)是以细胞异常增殖和转移为特点的一大类疾病，已经成为危害人类生命健康的头号杀手。2014年世界癌症报告预测，2012年到2025年全球癌症病例将从1400万人递增至1900万人，到2035年将达到2400万人。药物疗法(化疗)是目前癌症最主要的治疗手段。与传统化学治疗药物相比，天然产物(尤其是中药)以其安全低毒等优点逐渐受到世界医药工作者的广泛青睐。灵芝作为一种药用价值极高的真菌在我国及其他亚洲国家已有悠久的药用历史，是我国中医药宝库中的珍品。灵芝中的特征性成分三萜类化合物具有很好的抗肿瘤作用，目前已被开发成多种产品用于肿瘤病人的辅助治疗药物。《中国药典》记载：灵芝为多孔菌科灵芝属真菌赤芝G.lucidum和紫芝G.sinense.的干燥子实体。是历史悠久的名贵药食两用真菌之一，始载于《神农本草经》，历代医术将其列为上品，具有补中益气、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效，其药用价值已被世界公认，至今盛用不衰。现代医学研究揭示灵芝具有抗肿瘤、增强免疫、保肝、抗HIV和降血糖等药理作用。灵芝的神奇功效离不开它的物质基础。目前，灵芝三萜和多糖被认为是灵芝的主要有效成分，而其中的三萜更是因为其多种重要药理活性被认为是评价灵芝产品质量好坏的标准。灵芝三萜不但是近年来学术界的研究热点，也被认为是极有希望的作为新药创制的化学团体。目前已从灵芝中发现了100余种三萜类化合物，主要为C30，C27和C24的羊毛甾烷类三萜。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有新型结构和抗肿瘤功能的灵芝羊毛甾醇衍生物，同时提供一种该灵芝羊毛甾醇衍生物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。第一方面，本专利技术涉及一种灵芝羊毛甾醇衍生物，其结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：其中，式(Ⅰ)中：R1为羟基或者羰基，R2为氢、羟基或者甲氧基，R3和R4为甲基或者羟甲基；式(Ⅱ)中：R1为羟基或者羰基，R2为氢、羟基或者羰基，R3和R4为氢或者羟基。优选的，所述灵芝羊毛甾醇类衍生物为化合物1、2、3、4中的一种，所述化合物1、2、3、4的结构如下：第二方面，本专利技术涉及一种制备上述灵芝羊毛甾醇衍生物的方法，具体包括以下步骤：(1)提取灵芝粗提物：用乙酸乙酯溶液加热回流提取灵芝初提物，浓缩得浸膏(GL)；(2)硅胶柱层析：用氯仿甲醇混合溶液溶解浸膏(GL)，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后将吸附有灵芝粗提物的硅胶添加到层析柱中吸附剂的上面，进行硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇按体积比100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、50:50和0:100作为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比95：5洗脱的馏分，浓缩得到GL-3；(3)ODS中低压柱层析：以甲醇-水的体积比30:70、50:50、70:30、80:20、90:10和100:0作为洗脱剂，将GL-3进行ODS中低压柱层析梯度洗脱，分别收集甲醇-水体积比70：30洗脱的馏分GL-3-3和体积比80：20洗脱的馏分GL-3-4；(4)高效液相色谱：以80％甲醇-水为流动相，流速为12mL/min，馏分GL-3-4经高效液相色谱纯化得到化合物1、2和3；以70％甲醇-水为流动相，流速为12mL/min，馏分GL-3-3经高效液相色谱纯化得到化合物4。优选的，上述灵芝羊毛甾醇衍生物的制备方法，步骤(1)中，回流温度为20～70℃，提取次数为2～3次，每次提取时间为2小时。上述灵芝羊毛甾醇衍生物的制备方法，步骤(2)中，氯仿甲醇溶液中氯仿的体积分数为0～95％。第三方面，本专利技术涉及上述灵芝羊毛甾醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种以上述灵芝羊毛甾醇衍生物为活性成分的抗肿瘤药物。本专利技术从多孔菌科灵芝属赤芝(Ganodermalucidum)中分离得到4个羊毛甾醇衍生物，经鉴定，均为具有新颖结构的三萜化合物；运用体外抗肿瘤细胞增殖筛选体系进行活性评价，发现本专利技术所述灵芝羊毛甾醇衍生物能有效地抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)和人肝癌细胞(HepG2)的增殖，表明本专利技术灵芝羊毛甾醇衍生物具有预防和治疗肿瘤的作用，可以在制备抗肿瘤药物中应用，具有良好的研究开发前景。【附图说明】图1为灵芝羊毛甾醇衍生物1的抗肿瘤细胞增殖的检测图；图2为灵芝羊毛甾醇衍生物2的抗肿瘤细胞增殖的检测图；图3为灵芝羊毛甾醇衍生物3的抗肿瘤细胞增殖的检测图；图4为灵芝羊毛甾醇衍生物4的抗肿瘤细胞增殖的检测图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中，质谱仪为美国Finnigan公司生产的LCQ-Advantage质谱仪；超导核磁共振仪为Bruker AVANCE III 600；薄层色谱用硅胶GF254购自青岛海洋化工厂；反相ODS填料(40-63μm)为日本YMC公司产品；分析型色谱柱为YMC-Pack Pro C18(5μm，4.6×250mm)色谱柱液相YMC-Pack Pro C18(5μm，20×250mm)，色谱级甲醇购自天津四友精细化学品有限公司产品，水为怡宝纯净水。在未作说明的情况下，本专利技术采用的其他试剂、设备和方法均为本
常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。实施例1：灵芝羊毛甾醇衍生物的分离纯化取多孔菌科真菌灵芝属赤芝(Ganodermalucidum)6kg，用10倍量(质量/体积，g/ml)的乙酸乙酯加热(60℃)回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状，得到粗提取物GL；用3倍量(质量/体积，g/mL)的氯仿甲醇(1:1)溶液溶解粗提取物GL，均匀拌入硅胶中，挥干溶剂后将吸附有粗提取物GL的硅胶添加到层析柱中吸附剂的上面，进行硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇按体积比100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、50:50和0:100作为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比95：5洗脱的馏分，浓缩得到GL-3；以甲醇-水的体积比30:70、50:50、70:30、80:20、90:10和100:0作为洗脱剂，将GL-3进行ODS中低压柱层析梯度洗脱，分别收集甲醇-水体积比70：30洗脱的馏分GL-3-3和体积比80：20洗脱的馏分GL-3-4；以80％甲醇-水为流动相，流速为12mL/min，馏分GL-3-4经高效液相色谱(仪器：ShimadzuLC-20A)纯化得到化合物A(9.7min)、B(12.5min)和C(26.7min)；以70％甲醇-水为流动相，流速为12ml/min，馏分GL-3-3经高效液相色谱(仪器：ShimadzuLC-20A)纯化得到化合物D(15.8min)。化合物1、2、3、4进行结构分析化合物1-4的物理化学常数如下：化合物A：白色粉末；Liebermann-Burchard反应阳性；UV(MeOH)λmax254.2nm；ESI-MS：m/z999[2M+Na]+、511[M+Na]+、m/z487[M-H]-、975[2M-H]-；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灵芝羊毛甾醇衍生物，其特征在于，所述灵芝羊毛甾醇衍生物的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：其中式(Ⅰ)中：R1为羟基或者羰基，R2为氢、羟基或者甲氧基，R3和R4为甲基或者羟甲基；式(Ⅱ)中：R1为羟基或者羰基，R2为氢、羟基或者羰基，R3和R4为氢或者羟基。

【技术特征摘要】
1.一种灵芝羊毛甾醇衍生物，其特征在于，所述灵芝羊毛甾醇衍生物的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：其中式(Ⅰ)中：R1为羟基或者羰基，R2为氢、羟基或者甲氧基，R3和R4为甲基或者羟甲基；式(Ⅱ)中：R1为羟基或者羰基，R2为氢、羟基或者羰基，R3和R4为氢或者羟基。2.根据权利要求1所述的灵芝羊毛甾醇衍生物，其特征在于，所述灵芝羊毛甾醇类衍生物为化合物1、2、3、4中的一种，所述化合物1、2、3、4的结构如下：3.一种制备权利要求1或2所述的灵芝羊毛甾醇衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备灵芝粗提取物：用乙酸乙酯溶液加热回流，提取灵芝粗提取物，浓缩得浸膏(GL)；(2)硅胶柱层析：用氯仿甲醇混合溶液溶解浸膏(GL)，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后将吸附有灵芝粗提物的硅胶添加到层析柱中吸附剂的上面，进行硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇按体积比100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、50:50和0:100作为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比95：5洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少丹，李向敏，苏冀彦，谢意珍，帅欧，焦春伟，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，广东粤微食用菌技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44