本发明专利技术涉及分析检测技术领域，为解决目前检测CML和CEL方法中存在不同原料基质会影响检测方法的问题，本发明专利技术提出了一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，以d4‑CML和d4‑CEL为内标，采用多选择反应监测模式，通过方法学论证，构建了同步测定绿茶中CML和CEL的定量分析方法，为茶叶中AGEs的监测和控制提供基础。本发明专利技术的检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中CML和CEL的实际检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测
，具体地说涉及一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法。
技术介绍
我国茶园面积、茶叶产量位居世界第一，是茶业大国。茶叶种类多，内质成分丰富，加工工序多样，制茶过程中内质成分会发生复杂的化学变化，易产生晚期糖基化末端产物(Advanced Glycation End Products，AGEs)等潜在危害物，茶叶加工过程安全已成为茶叶质量安全领域关注的新焦点。AGEs是美拉德反应的产物之一，是一类结构复杂的化合物，具有不可逆性、交联性、不易被降解、结构异质性、酶稳定等特性。目前鉴定出的主要产物有羧甲基赖氨酸(N-(carboxymethyl)lysine，CML)、羧乙基赖氨酸(N-(carboxyethyl)lysine，CEL)等20多种，其中，CML和CEL是常见的两种，被认为与糖尿病、肾病、衰老等的发生和发展有关。目前已有报道采用LC-MS/MS分析方法测定食品基质中的CML和CEL，该法预处理相对简单，检测速度快，重现性好，稳定性好，但不同原料基质会影响方法的适用性。
技术实现思路
为解决目前检测CML和CEL方法中存在不同原料基质会影响检测方法的问题，本专利技术提出了一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，本专利技术的检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中CML和CEL的实际检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，所述的检测方法为：(1)对茶叶粉末样品脱脂处理，然后将样品吹干后依次加入硼酸钠缓冲液和硼氢化钠溶液，在0-6℃还原2-10h，优选为8h，再加入氯仿和甲醇混合液，离心后向得到的沉淀物中加入酸溶液，水解反应，完成后将水解样品进行定容、过滤并收集滤液；所述的脱脂处理步骤为：将茶叶粉末样品中加入正己烷振荡后离心，弃去溶剂，重复若干次，其中离心速率为5000-12000rpm，离心时间为4-10min。正己烷的作用为溶剂，使用量为使茶叶全部浸在溶剂中的量。所述的硼酸钠缓冲液浓度为0.1-0.3mol/L，硼氢化钠浓度为0.8-1.2mol/L，pH调节为8.5-10.0，所述的茶叶粉末样品、硼酸钠缓冲液和硼氢化钠溶液的重量体积比为1g∶8-12mL∶4-6mL。作为优选，氯仿和甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1-3∶1。作为优选，水解反应中酸溶液选自浓度为4-8mol/L的HCl溶液，更优选为6mol/L的HCl溶液；水解反应条件为在100-120℃下反应12-30h，更优选为在110℃下反应24h。(2)取滤液，定量加入同位素标记羧甲基赖氨酸和同位素标记羧乙基赖氨酸的标准溶液，得到预处理样品；所述的滤液中同位素标记羧甲基赖氨酸的添加浓度为10-200ng/mL，同位素标记羧乙基赖氨酸的添加浓度为10-200ng/mL。作为优选，所述的滤液中同位素标记羧甲基赖氨酸的添加浓度为40-100ng/mL，同位素标记羧乙基赖氨酸的添加浓度为40-100ng/mL。(3)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；所述的净化方法为：对固相萃取柱进行预处理后，将步骤(2)得到的预处理样品进行上样，然后依次用浓度为0.08-0.15mol/L的盐酸溶液和超纯水淋洗进行上样吸附，再用体积浓度为4-6％的氨水-甲醇溶液淋洗进行样品洗脱，收集洗脱液，吹干，超纯水复溶，得到待测液；所述的盐酸溶液、超纯水、氨水的体积比为1∶0.5～2∶0.5～2。所述上样、上样吸附、洗脱时的流速可以为0.3-0.8mL/min，优选0.5mL/min。采用0.5-1.5mL纯水复溶，过0.22μm的滤膜，-20℃保存，待检。作为优选，所述固相萃取柱的预处理方法可以为：依次采用2-4mL甲醇和2-4mL浓度为0.08-0.15mol/L的盐酸溶液对固相萃取柱进行淋洗，流速0.5-1.5mL/min。(4)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的含量。高效液相色谱测定条件为：流动相A包括体积百分比浓度为0.1％甲酸溶液与体积百分比浓度为99.9％浓度为8-12mmol/L的乙酸铵，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序，流速0.2mL/min，进样量10μL，柱温38-42℃，所述的梯度洗脱
程序为：质谱条件为：离子化方式为ESI离子源；扫描方式为正电离；检测方式为多离子反应监测，碰撞能量为20eV；离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V，其中：本专利技术针对绿茶基质特性，优化样品前处理方法，以d4-CML和d4-CEL为内标，采用多选择反应监测(MRM)模式，通过方法学论证，构建了同步测定绿茶中CML和CEL的定量分析方法，为茶叶中AGEs的监测和控制提供基础。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中CML和CEL的实际检测。附图说明图1为实施例CML标准曲线图；图2为实施例CEL标准曲线图；图3为实施例混标中CML、d4-CML、CEL和d4-CEL的MRM质谱图；图4为实施例绿茶样品中CML、d4-CML、CEL和d4-CEL的MRM质谱图。具体实施方法下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或用常规方法制备。实施例中CML标准品(纯度＞98％)和d4-CML同位素内标(纯度99％)，CEL标准品(纯度＞98.6％)和d4-CEL同位素内标(纯度98.6％)；所用仪器为：Agilent 6460 Triple Quad LC-MS(三重串联四极杆液质联用仪)，Agilent Zorbax SBC18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；SPE固相萃取柱Cleanert PCX(60mg，3mL，天津博纳艾杰尔有限公司)；粉碎机、电子天平、高速冷冻离心机、烘箱等均为实验室常规仪器或设备。实施例1(1)提取：称取50mg茶叶粉末样品置于10mL离心管中，加入2mL正己烷，剧烈振荡3min后，于10000rpm离心5min，弃去溶剂，重复以上步骤2次。经正己烷脱脂后，将样品利用氮气吹干至恢复粉末状。向样品中加入1mL Na2B4O7缓冲液(0.2mol/L)和0.5mL NaBH4(1mol/L，以0.1mol/LNaOH配制)，调节pH＝9.2，于4℃还原过夜(约8h)。接着，加入1mL氯仿/甲醇(2∶1，v/v)，于10000rpm离心10min后，弃去上清液；向得到的沉淀物中加入5mL HCI(6mol/L)，置于110℃烘箱中，水解12h。水解完成后，将水解样品取出并冷却至室温(25℃)，用超纯水定容至10mL，然后用定性滤纸过滤并收集滤液。(2)准确量取0.4mL滤液，加入0.4μg/mL d4-CML和0.4μg/mL d4-CEL内标各100μL。(3)净化：SPE柱预处理：3mL甲醇，3mL 0.1M的HCl，流速为1mL/min；上样吸附：用3mL 0.1M的HCl，3mL超纯水淋洗，流速为0.5mL/min；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，其特征在于，所述的检测方法为：(1)对茶叶粉末样品脱脂处理，然后将样品吹干后依次加入硼酸钠缓冲液和硼氢化钠溶液，在0‑6℃还原2‑10h，再加入氯仿和甲醇混合液，离心后向得到的沉淀物中加入酸溶液，水解反应，完成后将水解样品进行定容、过滤并收集滤液；(2)取滤液，定量加入同位素标记羧甲基赖氨酸和同位素标记羧乙基赖氨酸的标准溶液，得到预处理样品；(3)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；(4)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的含量。
【技术特征摘要】
1.一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，其特征在于，所述的检测方法为：(1)对茶叶粉末样品脱脂处理，然后将样品吹干后依次加入硼酸钠缓冲液和硼氢化钠溶液，在0-6℃还原2-10h，再加入氯仿和甲醇混合液，离心后向得到的沉淀物中加入酸溶液，水解反应，完成后将水解样品进行定容、过滤并收集滤液；(2)取滤液，定量加入同位素标记羧甲基赖氨酸和同位素标记羧乙基赖氨酸的标准溶液，得到预处理样品；(3)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；(4)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的含量。2.根据权利要求1所述的一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，其特征在于：步骤(1)脱脂处理步骤为：将茶叶粉末样品中加入正己烷振荡后离心，弃去溶剂，重复若干次，其中离心速率为5000-12000rpm，离心时间为4-10min。3.根据权利要求1所述的一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，其特征在于：步骤(1)所述的硼酸钠缓冲液浓度为0.1-0.3mol/L，硼氢化钠浓度为0.8-1.2mol/L，pH调节为8.5-10.0，所述的茶叶粉末样品、硼酸钠缓冲液和硼氢化钠溶液的重量体积比为1g∶8-12mL∶4-6mL。4.根据权利要求1所述的一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，其特征在于：步骤(1)中氯仿和甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1-3∶1。5.根据权利要求1所述的一种同步检测绿茶中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，其特征在于：步骤(1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王彬，刘婧，田野，曾丽珍，刘青茹，周春江，蒋玉兰，唐靖，邸胜达，
申请(专利权)人：中华全国供销合作总社杭州茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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