一种平贝母药材指纹图谱的建立方法技术

本发明专利技术提供了平贝母药材生物碱类指纹图谱的建立方法，包括对照品制备、供试品制备、采用蒸发光散射器高效液相色谱法(ELSD‑HPLC)获取所述平贝母药材的指纹图谱的步骤。色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂：以0.1％三乙胺(含1mmol/L的乙酸铵)的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。本发明专利技术指纹图谱相似度高，分离度、精密度、稳定性和重现性良好，色谱检测时间在60min内，为检测平贝母药材质量提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中药药材的质量控制方法，特别涉及平贝母药材高效液相色谱法指纹图谱的建立方法。
技术介绍
平贝母为百合科贝母属多年生草本植物平贝母(Fritillaria ussurienis Maxim)的干燥鳞茎，又名平贝，是药用贝母的一种，收载于2010版《中国药典》及香港中药材标准第三期(2010年)。平贝母主产东北三省，性苦、甘，微寒；归肺、心经。早在秦汉时期《神农本草经》将贝母列为中品，能清热润肺，化痰止咳，用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳咳、咳痰带血。甾体生物碱成分是现有文献报道的公认的平贝母药材的主要活性成分，也是作为平贝母清热润肺、化痰止咳的物质基础。目前中国药典(2010年)控制平贝母药材质量的方法主要包括性状鉴定、薄层鉴别及含量测定等方法。含量测定主要通过利用分光光度法测定平贝母药材中总生物碱含量来达到控制平贝母药材质量的目的。而香港中药材标准第三期(2010年)还收载了平贝母的指纹图谱，但其方法中供试品制备取样量大，因使用三氯甲烷为提取溶剂且量多，毒性大，指纹图谱特征峰较少。闵会等研究了不同贝母的指纹图谱鉴别研究，指纹图谱只分离出了7个特征峰，对于药材中可能存在的其他共同特征峰或许没有完全被检测。贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、西贝母碱为平贝母中主要的生物碱，由于它们缺少发色团，无紫外吸收，因此不能用紫外吸收检测器检测。研究者用薄层扫描法、柱前衍生化法、质谱液相联用法、气相色谱法测定平贝母中这类生物碱含量，但多因检测的局限性难以得到理想的结果。近年，使用高效液相色谱法检测平贝母中生物碱成分的研究较多，李慧婷等人用ELSD-HPLC测定平贝母中贝母素甲、贝母素乙含量，吴晓民等人用HPLC测定平贝母中贝母甲素的含量，洪梅等人用ELSD-HPLC等度洗脱测定平贝母中贝母素甲的含量，这些方法只能测定一种或两种生物碱成分，并不能完全反映药材的整体特征。王世曼等人曾用HPLC研究吉林产贝母生物碱不同提取方法的指纹图谱，以贝母素乙为参照，但经查阅文献，贝母素乙在平贝母中含量极低，以贝母素乙为参照会对准确性造成一定的影响。
技术实现思路
本专利技术涉及平贝母药材高效液相色谱法指纹图谱的建立方法，以及由此方法得到的平贝母药材的标准指纹图谱。通过测定平贝母药材的指纹图谱有效地控制平贝母药材的质 量，弥补了现有质量控制技术的不足，从而确保平贝母药材的有效性、稳定性和均一性。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：一种平贝母药材的指纹图谱，该方法包括采用高效液相色谱法对平贝母进行检测，其中色谱条件包括；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为含1mmol/L乙酸铵的0.1％三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱步骤如下，其中流动相比例均为体积百分比：0～8min，流动相A为70％～65％，流动相B为30％～35％；8～25min，流动相A为65％～55％，流动相B为35％～45％；25～40min，流动相A为55％～5％，流动相B为45％～95％；40～43min，流动相A为5％，流动相B为95％；43～48min，流动相A为5％～70％，流动相B为95％～30％；48～58min，流动相A为70％，流动相B为30％。所述平贝母指纹图谱的建立方法，还包括通过以下步骤制备对照品溶液：取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、西贝母碱四种生物碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml含贝母辛0.140mg、贝母素甲0.133mg、贝母素乙0.100mg、西贝母碱0.372mg的混合对照品溶液，即得。所述平贝母指纹图谱的建立方法，还包括通过以下步骤制备供试品溶液：把平贝母打粉，过四号筛，取2g平贝母药材粉末，加氨水4ml浸润2h，用比例为4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液40ml回流提取，过滤。取滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解定容至2ml，12000r/min离心10min沉淀不溶性物质，取上清液，将上清液与1g硅胶混合均匀，通过内径为1.5cm、填料重量为5g的薄层层析硅胶柱，以水30ml洗脱，弃去水洗液，继用比例为9:1的乙酸乙酯-甲醇40ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解定容至2ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。优选地，所述平贝母指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(a)制备供试品溶液：把平贝母打粉，过四号筛，取2g平贝母药材粉末，加氨水4ml浸润2h，用比例为4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液40ml回流提取，过滤。取滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解定容至2ml，12000r/min离心10min沉淀不溶性物质，取上清液，将上清液与1g硅胶混合均匀，通过内径为1.5cm、填料重量为5g的薄层层析硅胶柱，以水30ml洗脱，弃去水洗液，继用比例为9:1的乙酸乙酯-甲醇40ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解定容至2ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(b)制备对照品溶液：取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、西贝母碱四种生物碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml含贝母辛0.140mg、贝母素甲0.133mg、贝母素乙 0.100mg、西贝母碱0.372mg的混合对照品溶液，即得；(c)测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据以下条件进行测定，得到平贝母药材指纹图谱；其中，色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为含1mmol/L乙酸铵的0.1％三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱步骤如下，其中流动相比例均为体积百分比：0～8min，流动相A为70％～65％，流动相B为30％～35％；8～25min，流动相A为65％～55％，流动相B为35％～45％；25～40min，流动相A为55％～5％，流动相B为45％～95％；40～43min，流动相A为5％，流动相B为95％；43～48min，流动相A为5％～70％，流动相B为95％～30％；48～58min，流动相A为70％，流动相B为30％；流速为1ml/min；柱温为25℃；进样量为10μl；蒸发光散射器的条件包括：漂移管温度：85℃；雾化器流速：2.2L/min；Grain：1。所述平贝母指纹图谱的建立方法，还包括：对多个平贝母指纹图谱进行比较，选出共有特征峰，得到平贝母特征指纹图谱。所述平贝母指纹图谱的建立方法，在于平贝母指纹图谱或平贝母特征指纹图谱中，以贝母辛对照品为参照峰，各特征峰的相对保留时间如下：峰1:0.79、峰2:0.97、峰3:1.00、峰4:1.32、峰5:1.51、峰6:1.83、峰7:2.10、峰8:2.21、峰9:2.28、峰10:2.32、峰11:2.43、峰12:2.59、峰13:2.62、峰14:2.74，其相对保留时间在上述值的±10％之内。所述平贝母指纹图谱或平贝母特征指纹图谱中，3号峰为贝母辛对照峰。本专利技术还提供一种平贝母药材的鉴定方法，该方法包括将根据上述方法建立待测样品指纹图谱或特征指纹图谱与根据上述方法建立的标准指纹图谱或特征指纹图进行比较。所述平贝母药材的鉴定方法，包括以下步骤：(a)测定待测平贝母药材生物碱类指纹图谱；(b)将待测平贝母药材指纹图谱与标准指纹图谱对比，以特征峰计算，相似度不低于0.85的药材质量合格，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种平贝母药材生物碱类指纹图谱的建立方法，其特征在于：该方法包括采用高效液相色谱法对平贝母药材进行检测，其中色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为含1mmol/L乙酸铵的0.1%三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱步骤如下，其中流动相比例均为体积百分比：0~8 min，流动相A为70%~65%，流动相B为30%~35%；8~25 min，流动相A为65%~55%，流动相B为35%~45%；25~40 min，流动相A为55%~5%，流动相B为45%~95%；40~43 min，流动相A为5%，流动相B为95%；43~48 min，流动相A为5%~70%，流动相B为95%~30%；48~58 min，流动相A为70%，流动相B为30%。

【技术特征摘要】
1.一种平贝母药材生物碱类指纹图谱的建立方法，其特征在于：该方法包括采用高效液相色谱法对平贝母药材进行检测，其中色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为含1mmol/L乙酸铵的0.1%三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱步骤如下，其中流动相比例均为体积百分比：0~8 min，流动相A为70%~65%，流动相B为30%~35%；8~25 min，流动相A为65%~55%，流动相B为35%~45%；25~40 min，流动相A为55%~5%，流动相B为45%~95%；40~43 min，流动相A为5%，流动相B为95%；43~48 min，流动相A为5%~70%，流动相B为95%~30%；48~58 min，流动相A为70%，流动相B为30%。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过以下步骤制备对照品溶液：取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、西贝母碱四种生物碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml含贝母辛0.140 mg、贝母素甲0.133 mg、贝母素乙0.100 mg、西贝母碱0.372 mg的混合对照品溶液，即得。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过以下步骤制备供试品溶液：把平贝母打粉，过四号筛，取2g平贝母药材粉末，加氨水4ml浸润2 h，用比例为4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液40 ml回流提取，过滤，取滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解定容至2 ml，12000 r/min 离心10 min沉淀不溶性物质，取上清液，将上清液与1 g硅胶混合均匀，通过内径为1.5 cm、填料重量为5g的薄层层析硅胶柱，以水30 ml洗脱，弃去水洗液，继用比例为9:1的乙酸乙酯-甲醇40 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解定容至2 ml，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（a）制备供试品溶液：把平贝母打粉，过四号筛，取2g平贝母药材粉末，加氨水4ml浸润2 h，用比例为4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液40 ml回流提取，过滤，取滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解定容至2 ml，12000 r/min 离心10 min沉淀不溶性物质，取上清液，将上清液与1 g硅胶混合均匀，通过内径为1.5 cm、填料重量为5g的薄层层析硅胶柱，以水30 ml洗脱，弃去水洗液，继用比例为9:1的乙酸乙酯-甲醇40 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解定容至2 ml，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得；（b）制备对照品溶液：取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、西贝母碱四种生物碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml含贝母辛0.140 mg、贝母素甲0.13...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冠萍，林广莲，朱小凤，陈露，招丽君，林双，
申请(专利权)人：广西梧州制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45