新型IFN‑β蛋白类似物制造技术

技术编号:14009694 阅读:54 留言:0更新日期:2016-11-17 10:14
本发明专利技术提供了包含至少80%的脱酰胺的干扰素‑β(IFN‑β)蛋白的组合物,脱酰胺的IFN‑β1a蛋白,产生脱酰胺的蛋白质的方法,以及这类组合物和脱酰胺的IFN‑β1a蛋白的治疗用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】描述
技术介绍
天然干扰素(IFN-β)大都响应病毒感染或在接触其他生物物质之后由细胞产生。IFN-β涉及抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。多种重组人干扰素-β,称为干扰素-β1a和干扰素-β2b市售可得,用于治疗复发形式的多发性硬化(M Revel,Pharmacol Ther 2003年10月,100(1):49-62)。IFN-β1a是一种166个氨基酸的糖蛋白,其在残基上有单个N-连接的糖链。序列包含3个半胱氨酸,其中2个形成二硫键(Cys31和Cys141)并且一个Cys17是游离的并靠近表面,但被隐埋。干扰素-β1b是非糖基化的并且具有Cys17Ser突变。干扰素-β以多种方式显示其抗病毒功能;一种是从靶细胞引发抗病毒活性(抑制病毒复制)而另一种是诱导感染的细胞凋亡(Taniguchi等,Current Opinion in Immunology,2002年2月,14(1):111-116)。除了这种直接作用以外,干扰素-β影响免疫系统细胞并且其诱导细胞表面上MHC-I型分子的表达。然后通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)消除病毒感染的细胞。消除机制是基于对感染的细胞表面上MHC I型呈递的病毒抗原的CTL识别。免疫-肿瘤学是一种癌症护理的进化方法,其聚焦于重新引导患者的免疫系统以消除肿瘤。宿主系统清除肿瘤细胞的免疫机制之一是通过CTL杀死肿瘤细胞。消除机制是基于对肿瘤细胞表面上MHC I型呈递的肿瘤抗原的CTL识别。病毒和肿瘤可使用包括下调MHC I型表达的免疫逃逸机制。能够降低直接抗病毒应答和/或通过CTL消除感染细胞机制的分子以及具有直接抗增殖活性和/或重新引导宿主免疫系统杀伤肿瘤细胞的能力的分子具有作为新型和更强效抗病毒和癌症治疗剂的潜力。WO 2006/053134鉴定了在25℃和60%相对湿度持续6个月储存下显示至多40%脱酰胺的IFN-β1b蛋白。该蛋白有增加的抗病毒和抗增殖活性。还没有报告增加的免疫调节活性。因此,仍然需要提供新型和更强效的治疗性IFN-β类似物,尤其是IFN-β1a类似物。本专利技术的专利技术人惊讶地发现IFN-β1a在氨基酸25位处天冬酰胺处的脱酰胺导致增加的免疫调节,例如,MHC I型的上调和增加的抗病毒活性。另外,专利技术人意外发现免疫调节和抗病毒活性中脱酰胺诱导的增加取决于IFN-β1a的唾液酸化。此外,本专利技术的专利技术人发现导致IFN-β1a的几乎完全脱酰胺的特定脱酰胺条件。因此可以高生物功效和低成本产生本专利技术的脱酰胺的IFN-β蛋白。此外,单独或与其他治疗剂或手段联用的本专利技术的修饰的IFN-β蛋白可增强例如癌症免疫治疗剂和抗病毒治疗剂,如疫苗的临床功效。另外,IFN-β疗法可受益于使用较低剂量的IFN-β和与IFN-β治疗相关的副作用减少。
技术实现思路
本专利技术提供了包含干扰素-β(IFN-β)蛋白质,优选IFN-β1a的组合物,其中至少80%在对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素-β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺处脱酰胺。本专利技术还提供了修饰的干扰素-β(IFN-β)1a蛋白,其中对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素-β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺经脱酰胺。本专利技术还提供了用于治疗,用作免疫调节剂,用作疫苗或用于癌症免疫疗法的修饰的IFN-β1a蛋白或组合物。本专利技术的修饰的IFN-β1a蛋白具有SEQ ID NO:2定义的序列。本专利技术还提供用于治疗选自病毒感染、癌症和神经疾病的病症的修饰的IFN-β1a蛋白或组合物。本专利技术还提供对蛋白质,优选IFN-β,更优选IFN-β1a进行脱酰胺的方法,包括:(a)在碱性条件下孵育待脱酰胺的蛋白质约16至约24小时,优选20小时;并且(b)纯化脱酰胺的蛋白。附图的简要说明图1A和1B显示了人IFN-β-1a的一级结构(SEQ ID NO:1)和3D模型结构。IFN-β1a是一种166个氨基酸的糖蛋白,其在残基上有单个B-连接的糖侧链。序列包含3个半胱氨酸,其中2个形成二硫键(Cys31和Cys141)并且一个Cys17是游离的并靠近表面,但被隐埋。图2A是人工降解的IFN-β1a的RP-UPLC曲线;图2B是图2A的部分放大。图3A是未处理的IFN-β1a的脱酰胺水平;图3B是图3A的部分图像放大。图4A是人工脱酰胺的IFN-β1a的脱酰胺水平;图4B是图4A的部分图像放大。图5是重叠的未处理的IFN-β1a和人工脱酰胺的IFN-β1a的脱酰胺水平。图6A是人工去唾液酸化的IFN-β1a的脱酰胺水平;图6B是图6A的部分图像放大。图7A是人工脱酰胺并去唾液酸化的IFN-β1a的脱酰胺水平;图7B是图7A的部分图像放大。图8A和B是重叠的人工去唾液酸化的IFN-β1a和人工脱酰胺并去唾液酸化的IFN-β1a的脱酰胺水平。图9是MHC I型免疫调节生物试验:剂量响应曲线。图10是IFN-β1a的免疫调节生物活性。图11是A549/EMCV系统的抗病毒活性:剂量响应曲线。图12是IFN-β1a的抗病毒活性。专利技术详述本专利技术提供了包含干扰素-β(IFN-β),优选IFN-β1a的组合物,其中至少80%在对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素-β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺处脱酰胺(参考图1)。本专利技术还提供了修饰的IFN-β1a蛋白,其中对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素-β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺经脱酰胺。本专利技术的修饰的IFN-β1a蛋白具有SEQ ID NO:2定义的序列。优选地,组合物中至少85%、90%、95%或至少96%的IFN-β蛋白,例如IFN-β1a脱酰胺,最优选96%。脱酰胺是蛋白质的可能修饰途径之一。这种类型的修饰主要发生在天冬酰胺和谷氨酰胺残基处。对于经过脱酰胺的天冬酰胺,形成了三种可能的修饰产物:●琥珀酰亚胺中间体(其中,天冬酰胺酰蛋白已经失去了氨分子)●天冬氨酰蛋白(其中天冬酰胺已经转化成天冬氨酸)●异天冬氨酰蛋白(其中天冬酰胺已经转化成异天冬氨酸;在这种情况中,蛋白质主链在天冬氨酸侧链的COOH上连续,而不是氨基酸的COOH上)。最后两个修饰产物产生蛋白质的净电荷变化,因为天冬酰胺的天然氨基侧链已经转化成天冬氨酸的更酸性的羧基。不受任何理论限制,预期按照Asn25的空间位置(参见图1B),其脱酰胺成Asp25增加了与空间上靠近的Arg147的静电相互作用,可能与Arg147和Thr144形成额外的氢键。天冬氨酸和精氨酸之间的静电相互作用可能在精氨酸胍基的2个氮中心和/或羧基的2个氧原子上传递,如图1B所示。本文所述的组合物包含脱酰胺的IFN-β蛋白,例如IFN-β1a,其中待脱酰胺的氨基酸天冬酰胺的天冬酰胺残基被天冬氨酸残基、异天冬氨酸残基或环酰亚胺(imidid)残基如琥珀酰亚胺替换。优选地,约65%至约70%,更优选约68%的天冬酰胺残基被天冬氨酸替换,约15%至约20%,更优选约18%被异天冬氨酸替换,并且约8%至约13%,优选约11%被琥珀酰亚胺替换。类似地,在本文所述的修饰的IFN-β1a蛋白中,待脱酰胺的氨基酸天冬酰胺的天冬酰胺残基被天冬氨酸残基、异天冬氨酸残基或环酰亚胺残基如琥本文档来自技高网
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<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201580017819.html" title="新型IFN‑β蛋白类似物原文来自X技术">新型IFN‑β蛋白类似物</a>

【技术保护点】
一种包含干扰素‑β(IFN‑β)蛋白的组合物,其中至少80%的所述干扰素‑β蛋白在对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素‑β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺处脱酰胺。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.04 EP 14163483.21.一种包含干扰素-β(IFN-β)蛋白的组合物,其中至少80%的所述干扰素-β蛋白在对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素-β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺处脱酰胺。2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述IFN-β蛋白是IFN-β1a。3.如权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,在所述氨基酸天冬酰胺中,天冬酰胺残基被天冬氨酸残基、异天冬氨酸残基或环酰亚胺残基如琥珀酰亚胺替换。4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,约65%至约70%的天冬酰胺残基被天冬氨酸残基替换。5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物,其显示出增加的免疫调节活性。6.如前述权利要求中任一项所述的组合物,其特征在于,所述IFN-β蛋白经糖基化。7.如权利要求6所述的组合物,其特征在于,所述IFN-β蛋白具有在CHO细胞中产生的IFN-β蛋白的糖基化模式。8.如权利要求6所述的组合物,其特征在于,在所述IFN-β蛋白中,所有聚糖链经唾液酸化,优选如同CHO细胞进行的唾液酸化。9.一种修饰的IFN-β1a蛋白,其中对应于根据SEQ ID NO:1的干扰素-β1a蛋白的氨基酸25位的氨基酸位置上的氨基酸天冬酰胺经脱酰胺。10.用于治疗的如前述权利要求中任一项所述的组合...

【专利技术属性】
技术研发人员:W·帕林斯基M·罗西A·R·佩佐蒂
申请(专利权)人:阿雷斯贸易股份有限公司
类型:发明
国别省市:瑞士;CH

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