具有增加的稳定性的人源化抗体制造技术

本发明专利技术提供具有改进的稳定性的抗体。包括能够结合KIR3DL2多肽的抗体。所述抗体适合治疗以表达KIR3DL2的细胞、特别是CD4+ T细胞为特征的病症，包括恶性疾病如蕈样真菌病和塞扎里综合征，以及表达KIR3DL2的自身免疫性病症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供具有改进的稳定性的抗体。包括能够结合KIR3DL2多肽的抗体。所述抗体适合治疗以表达KIR3DL2的细胞、特别是CD4+T细胞为特征的病症，包括恶性疾病如蕈样真菌病(Mycosis Fungoides)和塞扎里综合征(Sezary Syndrome)，以及表达KIR3DL2的自身免疫性病症。相关申请的交叉引用本申请要求2014年3月14日提交的美国临时申请No.61/953,035的权益；所述临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中；包括任何附图。序列表的引用本申请是与序列表一起以电子格式提交的。所述序列表以创建于2015年3月11日的名称为“KIR-5PCT_ST25”的文件形式提供，其大小为49KB。所述序列表的电子格式的信息以全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)是一种受体家族，其与C型凝集素受体(CD94-NKG2)一起，被人类NK细胞和T淋巴细胞亚群用于特异性识别MHC I类分子。某些抑制性和活化性KIR具有高度相似的胞外结构域并且被相同的单克隆抗体识别，例如KIR2DL1和KIR2DS1被EB6识别，并且2DL2和2DS2被GL183识别。已经使用三个标准(胞外Ig样结构域(结构域D0、D1、D2)数目、胞质尾长度和序列类比数)将KIR蛋白分类成13个群组，即KIR3DL1–2、KIR3DS1、KIR2DL1–5和KIR2DS1–5。2个结构域的命名2D或3个结构域的命名3D给出Ig样结构域数目；具有长或短胞质域的受体被进一步分成L或S(Pascal V.等,2007,《免疫学杂志(J.Immunol.)》179:1625-1633)。所述抑制性受体具有长(L)胞质尾(即，KIR2DL或KIR3DL)，其含有在KIR与其I类HLA配体接合后变得酪氨酸磷酸化的典型ITIM。所述磷酸化ITIM募集含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(含Src同源2结构域的磷酸酶1和/或含Src同源2结构域的磷酸酶2)，其将细胞底物脱磷酸化，因此中止NK激活信号，即，回避具有适当的自MHC I类表达的靶细胞。具有短(S)胞质尾的受体缺乏ITIM(即，KIR2DS或KIR3DS)。这些激活KIR在其跨膜结构域内含有带电残基，从而促进与信号传导链KARAP/DAP12的相互作用。KIR2DS家族受体的接合已显示导致KARAP/DAP12介导的信号传导事件的级联，最终导致NK细胞溶细胞活性增加和促炎细胞因子如IFN-γ的产生(Pascal等,2007,《免疫学杂志(J.Immunol.)》179:1625-1633)。成熟NK细胞被预测为获得至少一种对自MHC I类分子具特异性的抑制性受体，其通常在功能上优于潜在自身反应性激活分子。提议NK细胞的反应代表KIR和其他受体的活化性和抑制性信号传导的综合结果。已经研究KIR3DL2作为治疗涉及表达KIR3DL2受体的CD4+T细胞、特别是CD4+T细胞的恶性疾病(包括恶性疾病如蕈样真菌病和塞扎里综合征)的靶标(参见例如PCT公开WO2010/081890和WO02/50122)。KIR3DL2的配体HLA-B27与脊柱关节病(SpA)强烈相关，脊柱关节病是以强直性脊柱炎(AS)为代表的一组使人衰弱的炎性关节炎病症。通过B27二聚体进行的KIR3DL2连接促进Th17和NK细胞亚群的存活(Bowness等,(2011),《免疫学杂志(Journal of immunology)》186:2672-2680；Chan等,(2005),《关节炎和风湿病(Arthritis Rheum)》52:3586-3595)。已经表明，在具有SpA的患者中存在增加比例的表达KIR3DL2的致病性Th17和NK细胞亚群。研究强烈表明，KIR3DL2-B27相互作用在SpA中发挥重要作用并且KIR3DL2是一种有前途的治疗靶标。已经报道了针对各种KIR3D多肽具反应性的抗体的存在。已经报道了两种抗KIR3DL2抗体的存在：Q241和Q66(Pende等,(1996),《实验医学杂志(J Exp Med)》184:505-518)。然而，这两种抗体是IgM同种型(五聚体)并且不容易适合制药用途；此外，如果它们的可变区被放在二价IgG型抗体的情况下，则其亲和力预期将是低的。报道了产生另一种抗体的被称为“AZ158”的细胞(Parolini,S.等,(2002)《白细胞分型(Leucocyte typing)》VII.D.Mason编辑,牛津大学出版社,牛津.415-417；PCT公开WO2010/081890)。抗体5.133可获自Miltenty Biotech(Auburn CA)。两种抗体AZ158和5.133都结合KIR3DL2以及KIR3DL1(和此外高度同源的KIR3DS1)。KIR3DL2和KIR3DL1共有相对高的氨基酸同一性并且结合KIR3DL2的各种HLA配体也被KIR3DL1识别。尽管存在产生AZ158、Q241和Q66的免疫化，但仍需要在治疗和其他应用中的改进的抗体。
技术实现思路
在一个方面，提供具有人类框架的抗KIR3DL2抗体，其在药物制剂中具有高亲和力抗原结合和稳定性。本专利技术人开发了具有不同单基因和嵌合性人类框架的抗体并且发现在重链中残基39处和在轻链中残基38处(Abnum)的某些氨基酸提供强烈增加的物理稳定性。已经使用抗体2B12和10G5的抗原组合区开发了示例性抗体。在2013年9月17日提交的PCT申请号PCT/EP2013/069302中描述了抗体2B12和10G5CDR。抗KIR3DL2mAb 2B12和10G5具有既不结合密切相关的(通过同源性)KIR3DL1也不造成KIR3DL2内化的有利特性。KIR3DL2内化强烈阻碍了基于ADCC的方法。所述抗体当具有适当同种型(例如IgG1)时能够介导ADCC，但也能够抑制KIR3DL2-HLA B27二聚体与KIR3DL2的相互作用。值得注意的是，可以在不造成受体内化的情况下实现配体阻断。因此阻断KIR3DL2的一种或多种天然配体的抗体非常适于以消耗性或非消耗性mAb形式治疗或预防炎性病症。由所述抗体结合的KIR3DL2上的表位已经被确定，因为抗体10G5和2B12都失去与在残基I60和G62处具有取代的KIR3DL2突变体的结合。抗体10G5进一步失去与在残基P14、S15和H23处以及在残基R13、A25和Q27处具有取代的KIR3DL2突变体的结合。所述抗体在如在细胞表面上表达的天然构型中彼此竞争结合于KIR3DL2多肽。在一个实施方案中，本专利技术提供人源化2B12或10G5抗体。在一个实施方案中，本专利技术提供在轻链和/或重链中具有嵌合性人类框架的人源化2B12或10G5抗体。提供这类人源化抗体的框架区(FR)中用于氨基酸取代的示例性互补决定区(CDR)残基或序列和/或位点，所述人源化抗体具有改进的特性，例如，较低的免疫原性、改进的抗原结合或其他功能特性和/或改进的物理化学特性，例如，更好的稳定性。在一个实施方案中，所述人类框架序列包含回复突变。本文提供的框架和可变区在药物制剂中存在的条件下在2B12和10G5上赋予高的物理稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中所述抗体包含人类重链和轻链可变区框架序列，其中所述重链框架包含在残基39处的谷氨酰胺并且所述轻链框架包含在残基38(Abnum编号)处的谷氨酰胺。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.14 US 61/953,0351.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中所述抗体包含人类重链和轻链可变区框架序列，其中所述重链框架包含在残基39处的谷氨酰胺并且所述轻链框架包含在残基38(Abnum编号)处的谷氨酰胺。2.如权利要求1所述的抗体，其中参考抗体包含人类IgG同种型的恒定区。3.如权利要求1至2所述的抗体，其中所述抗体可检测地降低(或消除)所述KIR3DL2与KIR3DL2的HLA天然配体之间的结合。4.如权利要求1至3所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)KIR3DL2多肽等位基因_*001，(b)KIR3DL2多肽等位基因_*002，和(c)KIR3DL2多肽等位基因_*007，在每种情况下其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。5.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合，所述抗体对具有氨基酸突变I60N和G62S的突变KIR3DL2多肽的结合降低。6.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合，所述抗体对具有氨基酸突变R13W、A25T和Q27R的突变KIR3DL2多肽的结合降低。7.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合，所述抗体对具有氨基酸突变P14S、S15A和H23S的突变KIR3DL2多肽的结合降低。8.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体当结合于表达KIR3DL2的细胞时不被内化。9.如权利要求1至8所述的抗体，其中所述抗体可检测地降低所述KIR3DL2与HLA-B27之间的结合。10.如权利要求1至9所述的抗体，其中所述抗体不会实质上结合于KIR3DL1多肽。11.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体与选自以下的抗体竞争结合KIR3DL2多肽：(a)分别包含含有SEQ ID NO:31和25的氨基酸序列的VH和VL区的抗体(2B12)，和(b)分别包含含有SEQ ID NO:14和9的氨基酸序列的VH和VL区的抗体(10G5)。12.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含(i)包含分别含有SEQ ID NO:2(HCDR1)、SEQ ID NO:3(HCDR2)和SEQ ID NO:4(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)的重链，和(ii)包含分别含有SEQ ID NO:5、6或7的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的轻链。13.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·高蒂尔，N·施奈德，
申请(专利权)人：先天制药公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR