本发明专利技术涉及一种黄粉虫肽的分离鉴定及功能分析方法，采用超声处理、技术筛选、超滤分子截流、分子筛、反相高压液相色谱(HPLC)柱层析、质谱和氨基酸分析等技术，从诱导的黄粉虫中分离到氨基酸序列为SEQ ID NO:1的八肽，并进一步验证其抗氧化活性，证实其抗氧化功能强于谷胱甘肽，为该天然抗氧化八肽的产品开发应用奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种黄粉虫八肽的分离鉴定方法及其应用，属于生物技术学领域。
技术介绍
黄粉虫(Tenebrio molitor Linne)别名大黄粉虫,黄粉甲,俗称面包虫,属昆虫纲,鞘翅目,拟步行甲科,粉虫属。黄粉虫原属仓库害虫,但近年来国内外广大科技工作者在实验材料选取,饲料生产和食品、保健品研发等领域对黄粉虫进行了深入的研究并取得了一系列重要的突破,给予其集实验昆虫和资源昆虫于一身的黄粉虫以“蛋白质饲料宝库”之美誉。黄粉虫是一种具有饲用、食用、药用等多种利用价值的昆虫资源,具有广阔的开发与利用前景。黄粉虫是一种高蛋白、高脂肪和氨基酸含量较全面的昆虫资源,其含有多种糖类、维生素、矿物质。已有的研究发现，1kg黄粉虫干粉含蛋白质489g、脂肪288g、糖类107g、硫胺素0.65mg、核黄素5.2mg、维生素4.4mg、钾13.7g、钙1.38g、磷6.83g、铁65mg，此外还富含钠、镁、锌、铜、锰、硒等矿物质元素。黄粉虫作为饲料昆虫历史悠久,已广泛用于多种饲养业。作为饲料,黄粉虫不仅蛋白质含量高,氨基酸比例合理,脂肪酸质量和微量元素含量均优于鱼粉；而且黄粉虫幼虫适宜活体直接饲喂,对动物生长的促进作用是其它饲料所不能比的。在家禽生产中,用黄粉虫饲喂雏鸡、鹌鹑、乌鸡、斗鸡、鸭、鹅等禽类,喂养的雏禽不仅生长发育快、产卵期提前,繁殖率及成活率都有提高,而且可抗病能力增强。但长期以来，对于黄粉虫如何提高饲喂雏禽抗病能力的研究却鲜有报导。自从Harman自由基理论的提出,人们逐渐认识到动物体内氧化产生的自由基与衰老和众多疾病密切相关。自由基，又称游离基，是独立存在、外层轨道上带有一个或一个以上未配对电子的原子、原子团或分子,其特点为化学反应活性高、不稳定。在机体内过多的自由基可损伤生物大分子,影响细胞的正常结构和功能。自由基可攻击生命大分子物质及细胞壁,造成机体的多种损伤和病变,加速机体的衰老。在食品等复杂体系中,过多自由基的存在也会严重影响体系的稳定性。动物体内有多种自由基,尤以氧自由基最多,也称为活性氧，它们是需氧生物有氧呼吸的产物。生物体内存在由抗氧化剂和抗氧化酶构成的抗氧化防御系统，该系统是需氧生物减轻氧化损伤而形成的氧化应激机制，正常情况下机体依靠体内的抗氧化防御系统一方面直接清除氧自由基,另一方面使受自由基损伤的生物大分子,在监视和修复系统的作用下得以改正,即使还剩下未被很好修复的细胞,也可通过凋亡机制由吞噬细胞清除,上述生物反应维持了自由基生成与清除的动态平衡。但当机体处于不良环境状态下,以及随着年龄的增长,体内的自由基将会产生过多或清除过慢。当活性氧的浓度超过细胞防御能力时,氧化损伤就可改变细胞的结构和功能,影响机体健康。目前,已知哺乳动物体内有两类消除自由基的系统:一类为酶促系统,主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)；另一类为非酶促系统,主要包括维生素E、维生素C、类胡萝卜素、白蛋白和金属结合蛋白。生理状况下,机体的自由基产生及清除处于平衡状态,一旦机体这种平衡失调,则自由基对组织细胞将产生不可逆转的损伤。上述自由基清除剂也称为抗氧化剂,可清除体内多余的自由基,减轻多余自由基对机体的损伤。已有研究证实,氧化损伤与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉硬化等的发病机理有关。动物体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平,防止脂质过氧化,帮助机体抵御疾病。由于天然抗氧化剂具有较强抗氧化活性和很高安全性,因此人们把研究重点逐步转向天然抗氧化剂,从各种植物、动物组织中提取,如茶多酚、大豆异黄酮、肌肽、枸杞多糖、大豆肽，以及慈菇、扇贝、六月霜的提取物等等。而且重要的是生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类,由于蛋白质具有优良的乳化特性,能在油水界面起介导作用,因此其在清除生物体内过量自由基,抑制膜脂质过氧化方面更具有重要意义。随着营养学和生物技术的发展,人们发现介于蛋白质和氨基酸间的肽类,由于其特殊的结构特点,与氨基酸和大分子蛋白质等相比较,其食用安全性更高,具有极强的活性和多样性,且其抗氧化性更为显著。通常把这类具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效的生物活性肽称为抗氧化活性肽(简称抗氧化肽)。抗氧化活性肽具有抑制体内血红蛋白、自由铁离子、体外单线态氧和脂氧合酶催化的脂肪酸败的功效。抗氧化肽的开发与应用已成为国内外研究的热点。肽类产品的制备途径通常分为：化学合成、生物工程(重组技术)和从生物中筛选天然肽类三种。化学合成常受到合成起始点的基础结构的限制，生物工程技术也存在如不正确转录而导致蛋白折叠不准确等问题，从生物中筛选天然肽来具有来源丰富、物质天然的有点，因而倍受研究者关注。针对抗氧化肽研究现状，本专利技术申请人选用黄粉虫之一长期以来重要的饲料蛋白资源进行研究，对其作为饲料的价值进行深入研究，进一步探究其提高饲喂动物抗病能力的机制，从黄粉虫体内经济、高效地分离获得一种新型抗氧化肽，并研究其抗氧化功能。
技术实现思路
技术问题本研究采用了超声处理、技术筛选、超滤分子截流、分子筛、反相高压液相色谱(HPLC)柱层析、质谱和氨基酸分析等技术，从超声诱导的黄粉虫中分离到一个全新的八肽，命名为TM-1，并鉴定其氨基酸的结构组成，并进一步验证其抗氧化活性，对其在体内的抗氧化调节机制进行深入系统的研究，从而为黄粉虫抗氧化肽的临床应用提供理论依据，并有望推进生物活性学理论的发展。技术方案本专利技术的一个方面涉及到黄粉虫抗氧化活性小肽的分离、纯化及质谱分析鉴定，首先利用超滤浓缩技术，通过微孔滤膜(排阻率为1000Da)在外来压力作用下，回收分子量1000Da以下的有效成分获得粗提物；将获得的粗提物经真空干燥，再次浓缩；浓缩后粉末经再溶解后，用分子筛和反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离，从而获得多种黄粉虫活性肽成分；将收获的各活性肽成分经MODIL-TOF质谱分析，测定上述活性肽的完整的氨基酸序列，并对上述活性肽组分的抗氧化功能进行检测，获得具有抗氧化功能的P-7组分，进一步分析得到该组分的氨基酸序列为IIVCPYDK，命名为TM-1。本专利技术的另一方面涉及一种黄粉虫天然抗氧化肽制品，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1 IIVCPYDK。本专利技术的再一方面涉及一种黄粉虫天然抗氧化肽制品的应用，将上述天然抗氧化肽制品用作饲料添加剂。进一步的，本专利技术操作的具体步骤如下：一种黄粉虫天然抗氧化肽的分离鉴定方法，具体步骤为：(1)样品处理，称取100g黄粉虫幼虫超声处理后，经液氮反复冻融、碾碎混匀，获得黄粉虫匀浆样品；(2)蛋白抽提，在上述获得的黄粉虫匀浆样品中加入50ml蛋白抽提液，置于4℃过夜处理，充分抽提后，将所获得的样品经离心4℃，12000g，30min处理后取上清备用，其中蛋白抽提液为50mM HEPES pH7.0,10mM b-ME,1mM EDTA,1.0mM Na3VO4 pH 7.0,50mM NaF pH 7.0,1mM PMSF,2mM benzamidine,1mg/ml leupeptin,pepstain A，aprotinin；(3)去除杂蛋白等大分子物质，将步骤(2)中获得的上清本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄粉虫天然抗氧化八肽，其特征在于，所述的八肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或在所述序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由此衍生获得的具有相同抗氧化功能的多肽。
【技术特征摘要】
1.一种黄粉虫天然抗氧化八肽，其特征在于，所述的八肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或在所述序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由此衍生获得的具有相同抗氧化功能的多肽。2.如权利要求1所述的黄粉虫天然抗氧化八肽的分离鉴定方法，其具体步骤为：(1)样品处理，称取100g黄粉虫幼虫超声处理后，经液氮反复冻融、碾碎混匀，获得黄粉虫匀浆样品；(2)蛋白抽提，在步骤(1)获得的黄粉虫匀浆样品中加入50ml蛋白抽提液，置于4℃过夜处理，充分抽提后，将所获得的样品经离心4℃，12000g，60min处理后取上清备用；(3)去除杂蛋白等大分子物质，将步骤(2)中获得的上清置于80℃水浴中充分反应1h后，再次离心，4℃，12000g，60min，分为三层，上层为多脂层，中层为小分子多肽层，下层为杂蛋白层，取中间上清液；(4)将步骤(3)中获得的上清液通过1000Da超滤膜进行超滤处理，超滤获得的样品进行真空冻干操作；(5)将步骤(4)真空冻干处理获得的粉末用0.01M PH7.2PBS溶液稀释，12000g离心10min，然后将获得的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓东，王为栋，张福波，葛珍珍，单虎，王述柏，秦志华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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