本发明专利技术公开了一种泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，由J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因，鸡泛素Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。发明专利技术人还建立相应构建方法，该法可同时将J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因与鸡泛素基因串联后插入到pVAX1载体中。体外实验证明，将重组质粒转染DF‑1细胞，重组质粒成功得到表达。在鸡免疫试验中，免疫鸡的抗体转阳率和后代雏鸡的抗体阳性率均有提高。本发明专利技术通过构建泛素介导的J亚群禽白血病病毒多基因共表达DNA疫苗，为J亚群禽白血病病毒新型疫苗的研制奠定了基础，为J亚群禽白血病病毒的净化提供一种有效的辅助手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于J亚群禽白血病
，尤其涉及一种泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)是1988年首次从白羽肉鸡中分离得到的一种禽白血病病毒新亚群。ALV-J与ALV-A、ALV-B一样，可引起机体发生免疫抑制，造成疫苗免疫失败，又严重影响禽类的生产性能，导致产蛋量和蛋品质的下降，严重影响养禽业的健康发展。相比于ALV-A、ALV-B，ALV-J水平传播速度更快、危害更大，目前该病已蔓延到许多国家，给养禽业带来重大经济损失。随着白羽肉种鸡引进ALV-J传入我国，并于1999年首次在上坪肉鸡中分离得到，之后不同地区、不同品系的鸡都有分离到ALV-J的报道，目前ALV-J已蔓延到地方品种鸡中，严重威胁我国养禽业的发展。虽然目前尚无有效的疫苗，但研制新型疫苗作为ALV净化的辅助手段仍受到人们的关注。DNA疫苗具有能够在机体内持续表达并产生较高水平的细胞和体液免疫、安全、稳定、制备简便等优点，成为研究的热点。gp85基因表达病毒表面蛋白，决定亚群特异性，是病毒进入宿主细胞复制、诱发肿瘤发生的必须条件。gp85表达的表面蛋白在ALV-J致病、致瘤中具有重要作用；p27基因表达核衣壳蛋白，该蛋白是主要的群特异性抗原，在所有亚群中高度保守；p10基因表达蛋白主要参与病毒早起感染和后期装配，目前未见p10基因用于构建基因疫苗的报道。泛素(Ubiquitin，Ub)是由76个氨基酸组成、高度保守、普遍存在于真核细胞内的小分子多肽。泛素及其对蛋白质的标志修饰(泛素化，ubiquitination or ubiquityrmtion)参与细胞内ATP依赖的选择性蛋白质降解过程，泛素-蛋白酶体途径的发现，引起了研究者的广泛关注。近年来，国内外已有学者利用泛素提高DNA疫苗的免疫效果，研究结果表明泛素融合质粒DNA能够诱导较强的细胞免疫反应。目前关于泛素增强禽类病原免疫应答研究报道甚少，尤其是针对病毒抗原的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒及其构建方法和应用，为J亚群禽白血病病毒新型疫苗的研制奠定基础。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，由J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因，鸡泛素Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。上述泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，为pVAX1-Ub-gp85-p27-p10。上述泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒具有序列表SEQ.ID.No.13的碱基序列。J亚群禽白血病病毒来自中国分离株GX13HG03。J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.3的碱基序列，鸡泛素Ub基因具有序列表SEQ.ID.No.12碱基序列。上述泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒的构建方法，运用PCR方法扩增获得J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因与鸡泛素基因，扩增所用引物F/R-gp85、F/R-p27、F/R-p10、F/R-Ub分别具有序列表SEQ.ID.No.4至SEQ.ID.No.11的碱基序列；将J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因与鸡泛素基因通过酶切位点相连的方法连接并进行PCR扩增，将PCR产物经Kpn I和Xho I双酶切后定向插入同样以Kpn I和Xho I双酶切处理的真核表达载体pVAX1中，即得泛素介导的J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因串联的真核表达质粒pVAX1-Ub-gp85-p27-p10。上述泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒在制备预防禽白血病DNA疫苗方面的应用。针对目前J亚群禽白血病防控存在的问题，专利技术人综合考虑后选择gp85、p27、p10基因作为核酸疫苗的靶基因，设计并构建了泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，由J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因，鸡泛素Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。专利技术人还建立相应的构建方法，该法可同时将J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因与鸡泛素基因串联后插入到pVAX1载体中。体外实验证明，将重组质粒转染DF-1细胞，利用间接免疫荧光(IFA)方法确定构建的重组质粒成功得到表达。在鸡免疫试验中，免疫鸡的抗体转阳率和后代雏鸡的抗体阳性率均有提高。本专利技术通过构建泛素介导的J亚群禽白血病病毒多基因(gp85、p27、p10)共表达DNA疫苗，为J亚群禽白血病病毒新型疫苗的研制奠定了基础，为J亚群禽白血病病毒的净化提供一种有效的辅助手段。附图说明图1是pVAX1-Ub-gp85-p27-p10双切鉴定结果图，图中：M为DL15000DNA Maker；1为pVAX1-Ub-gp85-p27-p10质粒经Kpn I+Xho I双酶切结果。图2是免疫荧光方法检测结果图，图中：A为pVAX1-Ub-gp85-p27-p10在DF-1细胞中瞬时表达结果(阳性)，B为pVAX1空载体转染结果(阴性)。具体实施方式1.1 毒株J亚群禽白血病病毒毒株GX13HG03(专利技术人实验室保存)。1.2 方法1.2.1 引物设计根据GenBank中已发表的J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因序列与鸡泛素基因序列设计引物，并在不同引物上分别加入了Hind III、BamH I、EcoR I、Xho I和Kpn I酶切位点，所有内切酶均购买于宝生物工程(大连)有限公司。gp85、p27、p10和泛素基因扩增引物序列见表1。表1 引物序列表1中，斜体部分为酶切位点，引物由北京华大基因公司合成。1.2.2 gp85、p27、p10、泛素基因的扩增GX13HG03毒株gp85、p27、p10基因的扩增：以毒株GX13HG03前病毒DNA为模板，分别扩增gp85、p27、p10基因。PCR反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。泛素基因的扩增：按照RNA抽提试剂盒说明书(北京康为世纪，超纯RNA抽提试剂盒)提取鸡肌肉组织总RNA，以之为模板参照MLV逆转录酶(宝生物工程(大连)有限公司，TaKaRa MLV，10000units)说明书进行反转录，获得cDNA。PCR体系配置参照说明书，PCR反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，62℃退火45秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。1.2.3 目的基因鉴定将目的基因gp85、p27、p10以及泛素分别与pUC-T克隆载体连接，连接体系见表2。表2 gp85、p27、p10、泛素、克隆连接体系将上述反应物轻轻混匀后于连接仪中22℃连接30min，之后转化DH5α感受态细胞，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，其特征在于由J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因，鸡泛素Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。
【技术特征摘要】
1.一种泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，其特征在于由J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因，鸡泛素Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。2.根据权利要求1所述的泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，其特征在于为pVAX1-Ub-gp85-p27-p10。3.根据权利要求1所述的泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.13的碱基序列。4.根据权利要求1所述的泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，其特征在于：所述J亚群禽白血病病毒来自中国分离株GX13HG03。5.根据权利要求1所述的泛素介导的表达J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重组质粒，其特征在于：所述J亚群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.3的碱基序列，...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦平，王培坤，毕玉彧，邹广珍，杨永立，林璐璐，秦丽莉，彭昊，磨美兰，韦天超，黄腾，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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