本发明专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种CAR‑T细胞毒性指示载体，该细胞毒性指示载体为一种重组慢病毒载体，由原始慢病毒载体和插入序列组成。插入序列从5’端到3’端依次为肿瘤相关靶抗原编码基因、连接肽编码基因和荧光素酶编码基因。当CAR‑T细胞与CAR‑T细胞毒性指示细胞混合后，指示细胞表达的肿瘤相关靶抗原能够靶向引导CAR‑T进行结合，并裂解指示细胞，释放荧光素酶。由于裂解细胞位于上清中，未裂解细胞位于沉淀中，因此通过检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，再根据指示细胞数目和荧光素酶活力值的关系，即可推算出裂解和未裂解细胞的数目，计算裂解细胞比例，指示CAR‑T细胞毒性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种CAR-T细胞毒性指示载体。
技术介绍
CAR-T细胞指能够表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的T细胞(CAR-T)，CAR由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T细胞治疗技术是指通过将上述CAR结构在体外进行基因重组得到重组质粒再在体外将其导入到患者的T细胞内，从而获得能够表达上述嵌合抗原受体的CAR-T细胞，然后经过纯化和体外大规模扩增后，再将上述CAR-T细胞输回患者体内行使杀灭肿瘤细胞的功能。CAR-T疗法的优势在于：第一、其与肿瘤抗原的结合不需要依赖于HLA的呈递，有效避免了肿瘤细胞HLA表达下调这一免疫逃逸机制；第二、由于CAR-T治疗的基本原理是按照抗体针对抗原或一个特殊靶点的特异性结合，CAR结构中包括一个肿瘤相关胞外抗原结合域，因此CAR-T治疗是一种专一性的靶向治疗，相比较而言，相对传统的细胞免疫治疗诸如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，Cytokine Induced Killer Cell)和NK自然杀伤细胞(NK，Natural Killer Cell)多半都属于非靶向特异的；第三、CAR-T疗法能够在短时间内产生大量具有肿瘤杀伤效力的T细胞。因此，CAR-T疗法对肿瘤的治愈具备重要临床应用前景。在医学研究和实际应用中，对CAR-T细胞毒性的指示或表征是一个不可避免的重要问题，如果不能更好地解决这一问题，CAR-T细胞治疗技术的研究和应用发展都将受到严重制约。然而，目前遍采用的方法是使用CAR-T杀伤离体培养的靶细胞，通过间接测定方法来检测其作用效果，从而得出实验结论；在目前常用的CAR-T细胞毒性测定方法中，在CAR-T细胞和靶细胞混合后，通常需要超过两天的培养期(如MTT比色法等)，因此所需检测时间相对较长。缺乏直接和高效的CAR-T细胞毒性检测方法成为了CAR-T细胞治疗技术研发和应用的一大障碍。综上所述，开发一种直接高效的CAR-T细胞毒性检测工具和相应检测方法，是CAR-T细胞治疗技术的研发和应用过程中亟待解决的重要问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有CAR-T细胞治疗研发中缺乏直接高效的细胞毒性检测方法的不足，提供一种CAR-T细胞毒性指示载体。该指示载体为重组慢病毒载体，且含有CAR-T可识别的肿瘤相关靶抗原基因和荧光素酶基因，使用此载体包装慢病毒，筛选到CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞，该稳转细胞裂解后释放出荧光素酶，荧光素酶活力值和指示细胞数目相关。当CAR-T细胞与CAR-T细胞毒性指示细胞混合后，指示细胞表达的肿瘤相关靶抗原能够靶向引导CAR-T进行结合，并裂解指示细胞，释放荧光素酶。由于裂解细胞位于上清中，未裂解细胞位于沉淀中，因此通过检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，可得推算裂解和未裂解细胞的数目，计算裂解细胞比例，指示CAR-T细胞毒性。一个方面，本专利技术提供了一种CAR-T细胞毒性指示载体，所述的CAR-T细胞毒性指示载体为一种重组慢病毒载体，所述的重组慢病毒载体由原始慢病毒载体和插入序列组成。所述的原始慢病毒载体可以为Plent-EF1α-Blasticidin-CMV、Plent-EF1α-Puro-CMV或Plent-EF1α-Neo-CMV，优选为Plent-EF1α-Puro-CMV或Plent-EF1α-Neo-CMV，进一步优选为Plent-EF1α-Puro-CMV。所述的插入序列从5’端到3’端依次为肿瘤相关靶抗原编码基因、2A肽编码基因和荧光素酶编码基因。所述的肿瘤相关靶抗原优选为CD分子。所述的CD分子可以为CD3、CD20、CD19、CD22、CD33、CD70或CD123，优选为CD19、CD20或CD123，进一步优选为CD19。所述的2A肽的功能是将肿瘤相关靶抗原编码基因和荧光素酶编码基因连接起来，使二者通过同一个启动子CMV表达，但最终形成两个不融合的蛋白，让二者分开行使各自功能。所述的2A肽可以为T2A、F2A或P2A；优选为F2A或P2A；进一步优选为P2A。所述的P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的P2A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述的荧光素酶优选为Luciferase，但并不局限于Luciferase。所述的Luciferase编码基因如SEQ ID NO：3所示。另一个方面，本专利技术提供了一种CAR-T细胞毒性指示细胞，其特征在于：所述的CAR-T细胞毒性指示细胞中含有上述CAR-T细胞毒性指示载体；所述的CAR-T细胞毒性指示细胞是使用本专利技术所述的CAR-T细胞毒性指示载体装慢病毒并筛选到的稳转细胞株。在一个优选的实施方案中，所述的CAR-T细胞毒性指示细胞为含有上述CAR-T细胞毒性指示载体的HEK293细胞。再一个方面，本专利技术提供了一种利用上述CAR-T细胞毒性指示载体或CAR-T细胞毒性指示细胞进行CAR-T细胞毒性检测的方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：(1)包装CAR-T细胞毒性指示载体，获得病毒颗粒；(2)使用步骤(1)获得的病毒颗粒感染细胞，获得CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞；(3)检测步骤(2)得到的CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞的荧光素酶活力值，根据荧光素酶活力值和指示细胞数量的关系绘制标准曲线；(4)将待检测的CAR-T细胞和步骤(2)得到的稳转细胞混合孵育后，分别收集上清和沉淀，检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，根据步骤(3)获得的标准曲线分别推算上清和沉淀中的细胞数目，按下式计算裂解细胞比例，指示CAR-T细胞毒性；被裂解的细胞比例＝上清细胞数/(上清细胞数+沉淀细胞数)。与现有技术相比，本专利技术提供的CAR-T细胞毒性指示载体、CAR-T细胞毒性指示细胞以及相应的CAR-T细胞毒性检测方法更加直接、高效、快速、稳定。本专利技术提供的CAR-T细胞毒性指示载体使用慢病毒载体作为原始载体，可根据具体需要使用原核宿主进行大规模制备或使用真核细胞构建指示细胞，工业化生产前景优异。众所周知，不同类型的肿瘤细胞合成的肿瘤相关靶抗原的种类和数量不同，本专利技术提供的CAR-T细胞毒性指示载体可根据具体需要装载不同的肿瘤相关靶抗原编码基因，用于检测针对不同类型肿瘤的CAR-T细胞毒性，灵活性和特异性更加优异。利用本专利技术提供的CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞株只需三步即可获得实验结果，实现对CAR-T细胞毒性情况的分析；在将CAR-T细胞和靶细胞(即本专利技术提供的稳转细胞)混合后，仅需10-18左右小时即可进行测定，比常规方法的相应步骤所需时间缩短2倍以上；并且检测稳定性高，多次平行检测结果间无明显差异。附图说明图1为实施例3中的CD19单克隆抗体免疫荧光染色结果。图2为实施例4步骤(1)获得的标准曲线。图3为实施例4中裂解细胞比例的柱状图。具体实施方式以下实施例的说明只是用于帮助理解本专利技术的方法及其核心思想。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本专利技术权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种CAR‑T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的指示载体为一种重组慢病毒载体，所述的重组慢病毒载体由原始慢病毒载体和插入序列组成。
【技术特征摘要】
1.一种CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的指示载体为一种重组慢病毒载体，所述的重组慢病毒载体由原始慢病毒载体和插入序列组成。2.如权利要求1所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的原始慢病毒载体为Plent-EF1α-Blasticidin-CMV、Plent-EF1α-Puro-CMV或Plent-EF1α-Neo-CMV。3.如权利要求1所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的插入序列从5’端到3’端依次为肿瘤相关靶抗原编码基因、2A肽编码基因和荧光素酶编码基因。4.如权利要求3所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的肿瘤相关靶抗原为CD分子；所述的CD分子为CD3、CD20、CD19、CD22、CD33或CD70；优选为CD19、CD20或CD123。5.如权利要求3所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的2A肽为T2A、F2A或P2A；优选为F2A或P2A。6.一种CAR-T细胞毒性指示细胞，其特征在于：所述的指示细胞中含有权利要求1-5任意一项所述的CAR-T细胞毒性指示载体。7.一种CAR-T细胞毒性检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，李欣，
申请(专利权)人：宜明细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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