本发明专利技术属于植物倍性检测领域，公开了一种尾巨桉流式检测的方法。该方法包括以下步骤：(1)取尾巨桉DH32‑29的嫩叶加入裂解液中，用刀片切嫩叶，裂解，得细胞裂解悬浮液；(2)将步骤(1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上清液，再次加入裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液；(3)向步骤(2)中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液；(4)向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液；(5)将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。该方法可实现野外取材后即时制备样品，获得的细胞核染色液2天(48小时)后做流式检测分析条件下，可确保检测效果的稳定性，解除了流式检测要采后即时进行检测的局限。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物倍性检测领域，特别涉及一种尾巨桉流式检测的方法。
技术介绍
流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是在二十世纪50年代诞生的一项新技术，但直到二十世纪80年代末期这项技术才在植物科学领域得到广泛应用，其主要应用于细胞核DNA含量测定，DNA倍性鉴定以及细胞周期分析等研究。该技术在植物中能否成功运用的关键点在于能否制备出植物材料的单细胞(或单细胞核)悬浮液，科研人员针对这一难题一直在不断改进细胞检测前处理技术，例如Heller(1973)利用水解酶消化植物的细胞壁来释放细胞核，但是这种方式很耗时，后人很少继续延用这种方法；在此之后，Ulrich(1986、1988)和Bergounioux等(1988，1992)改进了方法，利用完整原生质体的低渗裂解作用来释放细胞核，这一改进也很耗时，而且，从一些物种或某种组织类型获得完整的原生质体的难度也限制了这一应用。此外，Galbraith等(1983)开发了一种在裂解液中通过切碎植物组织的细胞进行核裂解的方法，这一方法快速，实用，并成为了一种在植物流式细胞术中裂解细胞核的主要且最可靠的方法。但是，因为植物存在解除细胞壁的固定和束缚时难度大等问题，因此，虽然有部分植物流式裂解的前处理获得了成功，但是，仍然有大量植物至今没有获得裂解效果达到流式检测要求的裂解液。特别是对于木本植物，其木质化程度高，不仅有坚固且厚的细胞壁，还含有大量次生代谢产物(如单宁酸等物质)——使细胞质对裂解液的染色抵抗作用大，这些因素导致裂解和悬浮单细胞时更加困难。在实践中，获得效果优良裂解液的物种也较少。并且，即使裂解获得了成功，也存在碎片多，细胞核不完整，细胞粘连聚集，染色不均匀，产量低和CV值(反应细胞核完整性的指标)达不到要求等问题。另外，叶片的新鲜程度也对检测结果有很大影响，已经开发出的裂解液要求采后要及时裂解和检测，否则，检测结果会受到很大影响，因为植物很多时候是野外取样，但流式细胞仪是大型仪器，不能随意搬动，很难达到处理后及时在野外或就近检测的要求，因此，如果样品在裂解后能够在常温下保持较长时间的达到检测效果的稳定，则可以解决这一难题。桉树(Eucalyptus)是世界三大速生树种之一，在世界林业产业中具有非常重要的地位，桉树现在也是中国人工林木材产量最多的树种。有如此重要地位和价值的树种，开发和推进包含其遗传育种在内的各项生物技术，发掘其利用潜力，进一步提高其生产、经济和社会效益，具有非常重要的意义。但因为其细胞核裂解技术一直未能开发成熟，其DNA倍性鉴定(主要用于桉树的倍性育种)、细胞周期、细胞凋亡和相关代谢等研究一直未能开展，严重制约了其倍性育种等育种技术的开展。
技术实现思路
为克服上述现有的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种尾巨桉流式检测的方法。本专利技术的另一目的在于提供上述尾巨桉流式检测的方法在细胞核DNA含量测定，DNA倍性鉴定以及细胞周期分析等方面的应用。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种尾巨桉流式检测的方法，主要包括以下步骤：(1)裂解：取尾巨桉DH32-29的嫩叶加入预冷的裂解液中，用刀片切嫩叶，使嫩叶的大小为0.0025～0.0225mm2，裂解，得细胞裂解悬浮液；(2)过滤：将步骤(1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上清液，加入预冷的裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液；(3)酶解：向步骤(2)中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液；(4)染色：向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液；(5)流式检测：将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。步骤(1)和步骤(2)中所述的裂解液的配方为0.2mol/L Tris，4mmol/L MgCl2·6H2O，2mmol/L EDTA Na2·2H2O，86mmol/L NaCl，10mmol/L焦亚硫酸钠，100mmol/L柠檬酸，1％(v/v)PVP-10，1％(v/v)Triton X-100，0.5％(v/v)Tween 20，裂解液的溶剂为双蒸水，pH＝7.5。常温下配制，于4℃冰箱保存。步骤(1)和步骤(2)中所述的预冷的裂解液是指温度保持在0～4℃的裂解液。步骤(1)中所述的裂解是指裂解5～20min。步骤(1)中所用的裂解液的用量为每40～50mg的嫩叶使用0.2～1mL的裂解液。步骤(2)中所述的过滤是指用300目的尼龙滤膜过滤，再过滤是指用400目的尼龙滤膜过滤。步骤(2)中所述的离心是指在4℃，1000rpm离心3～8min。步骤(2)中所述的重新悬浮的时间为5～20s。步骤(3)中所述的RNase酶溶液的浓度为1mg/mL，溶剂为双蒸水，酶解在37℃进行，酶解时间为30～45min。步骤(4)中所述的PI染液的浓度为1mg/mL，溶剂为双蒸水。步骤(4)中所述的染色在0～4℃下进行，染色时间至少为20min。步骤(1)中所用的裂解液、步骤(2)中所用的裂解液、步骤(3)中所用的RNase酶溶液以及步骤(4)中所用的PI染液的体积比为(0.2～1):(0.2～0.5):(0.002～0.006):(0.005～0.05)。上述的尾巨桉流式检测的方法在细胞核DNA含量测定，DNA倍性鉴定以及细胞周期分析等方面的应用。本专利技术的机理为：裂解液既要破坏植物细胞的既有结构，解除细胞壁对细胞的束缚和固定作用，使细胞核能够裂解出来，同时，还要保证整个检测过程中细胞核的稳定性，保护细胞核不被降解并且能够被染色；另外，还要保证细胞核不发生粘连。本专利技术的裂解液中各组分作用如下：Tris在裂解液中作为缓冲液，维持裂解液的稳定性；MgCl2·6H2O用来保持细胞核的完整性和稳定性，起到防止细胞核破裂的作用；EDTA(乙二胺四乙酸)和柠檬酸作为螯合剂，用来结合二价阳离子，充当核酸酶的辅酶，增强DNA的染色能力和效果；NaCl用于维持合适的离子强度；Triton X-100和Tween 20是非离子型洗涤剂，用来解除黏稠的细胞质对细胞核的包裹和隔离，释放细胞核，减少细胞核和碎片的聚合亲和力；焦亚硫酸钠和PVP-10(聚乙烯吡咯烷酮)起到防止木本植物所含酚类物质被氧化的作用，且可抵消细胞质对核DNA荧光染色的负面作用——木本植物酚类物质被氧化后，其细胞核会难以被染色。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：本流式裂解液，针对木本植物的特性，进行了改进：(1)木本植物含有更多的单宁等物质，细胞质粘稠度大，导致裂解和染色难度变大，因此，增加了抗氧化的成分焦亚硫酸钠和PVP-10；(2)针对木本植物木质化程度高，细胞壁坚固且厚、固着作用强，细胞难以分离出的特点，采用了Triton X-100和Tween20，减弱了细胞质对裂解液的染色抵抗作用，显著提高了细胞裂解率，获得了可达到检测要求(主要是碎片率，CV值等指标达到检测要求)的裂解效果。另外，采用本专利技术所述的裂解液进行裂解处理后，在常温25℃下保存48h后进行检测，发现其分析结果无明显变化，说明该裂解液具有良好的稳定性，可以实现野外取材后间隔2天(48小时)做流式检测分析的可行性，解除了流式检测要采后即时进行检测的局限，显著拓宽了流本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尾巨桉流式检测的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)裂解：取尾巨桉DH32‑29的嫩叶加入预冷的裂解液中，用刀片切嫩叶，使嫩叶的大小为0.0025～0.0225mm2，裂解，得细胞裂解悬浮液；(2)过滤：将步骤(1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上清液，加入预冷的裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液；(3)酶解：向步骤(2)中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液；(4)染色：向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液；(5)流式检测：将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。
【技术特征摘要】
1.一种尾巨桉流式检测的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)裂解：取尾巨桉DH32-29的嫩叶加入预冷的裂解液中，用刀片切嫩叶，使嫩叶的大小为0.0025～0.0225mm2，裂解，得细胞裂解悬浮液；(2)过滤：将步骤(1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上清液，加入预冷的裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液；(3)酶解：向步骤(2)中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液；(4)染色：向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液；(5)流式检测：将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。2.根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的裂解液的配方为0.2mol/L Tris·HCl，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/L EDTA Na2·2H2O，86mmol/L NaCl，10mmol/L焦亚硫酸钠，100mmol/L柠檬酸，体积分数为1％的PVP-10，体积分数为1％的Triton X-100，体积分数为0.5％的Tween 20，裂解液的溶剂为双蒸水，pH＝7.5，常温下配制，4℃冰箱保存；步骤(1)和步骤(2)中所述的预冷的裂解液是指温度保持在0～4℃的裂解液。3.根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩超，徐建民，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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