8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种氨酰基‑tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明专利技术还提供一种包含所述氨酰基‑tRNA合成酶突变体的翻译系统。本发明专利技术还提供一种能够催化8‑羟基喹啉生成8‑羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体，其含有的氨基酸序列由SEQ ID NO:5所示。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是于2013年3月22日提交的申请号为201310093794.6的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术属于生物化学领域。具体地，本专利技术提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本专利技术还涉及一种2-氨基-3-(8-羟基喹啉-5-基)丙酸(简称8-羟基喹啉丙氨酸，简写为HqAla)翻译系统。更具体地，本专利技术涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入目标蛋白质的翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的方法。本专利技术还涉及一种酪氨酸酚裂解酶突变体，其含有的氨基酸序列由SEQ ID NO：5所示，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸。最后，本专利技术还提供一种通过遗传编码包含能够螯合金属离子的非天然氨基酸的突变蛋白质来拓展蛋白功能的方法。
技术介绍
遗传编码螯合金属离子的非天然氨基酸是一种研究蛋白质传感器设计，金属酶工程以及蛋白核磁共振的有力工具，但是，受限于非天然氨基酸合成的复杂性，使得该方法不能被生物学家广泛地应用。本专利技术通过定向进化酪氨酸酚裂解酶，使其能够高效地催化一种新型非天然氨基酸-8-羟基喹啉丙氨酸的生物合成，该非天然氨基酸可以与多种过渡金属离子形成稳定复合物。酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL)，又名β-酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate，PLP)为辅酶。1987年，Kazakov等发现TPL分子由4个相同的分子量约为50kDa的亚基组成，每个亚基四聚体与4分子磷酸吡哆醛(PLP)结合在一起。TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将8-羟基喹啉代替苯酚后，可由8-羟基喹啉、丙酮酸钠和氯化铵可在TPL催化下生成8-羟基喹啉丙氨酸。遗传编码8-羟基喹啉丙氨酸还需要一种在目标蛋白中定点特异插入非天然氨基酸的方法，本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其专利技术名称为“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”；WO 2002/085923，其专利技术名称为“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”；WO 2004/094593，其专利技术名称为“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定点特异性插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，Angewandte Chemie Int.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods 36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.Opinion in Chemical Biology 9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。虽然目前本领域已有一套完善的系统可以定点特异性插入多种非天然氨基酸，但是由于8-羟基喹啉丙氨酸自身结构的特点，目前仍无报道可以成功地在蛋白中插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物。同时，目前报道中成功插入的其他非天然氨基酸均与8-羟基喹啉丙氨酸结构差异较大，导致本领域技术人员根本不会想到使用相同的系统去整合8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物。另外，正交氨酰基-tRNA合成酶的筛选工作量非常大，需要通过3轮正负筛选，即总共6轮筛选，才从突变库(包含上百万甚至上千万个克隆)中筛选得到本专利技术中所述的正交氨酰基-tRNA合成酶。同时由于筛选过程中经常会出现假阳性克隆，我们需要通过进一步的试验依次去验证它们插入非天然氨基酸的能力，无形中又增加了许多工作量。因此，本专利技术的内容具有重要的意义，也是首次在蛋白中成功地定点特异插入8-羟基喹啉丙氨酸，所产生的突变蛋白质不仅具有螯合金属离子的能力，并且能够作为特异性金属离子传感器。
技术实现思路
1、技术问题本专利技术提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示氨基酸和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用8-羟基喹啉丙氨酸(简写为HqAla)或其结构类似物优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入HqAla或其结构类似物。这是本专利技术人首次发现的，相应地，在本专利技术中将其命名为正交8-羟基喹啉丙氨酸氨酰基-tRNA合成酶(HqAlaRS)。在整个本专利技术的说明书中，术语“8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物”是指选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐或酯、对羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯的化合物。本专利技术还提供一种酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，简写为TPL)突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体可以高效地催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列为：(1)SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或(2)将SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性的由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。此外，本领域技术人员应该理解，在本专利技术中，术语“能够催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体”不仅包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，还包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8‑羟基喹啉生成8‑羟基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示。

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示。2.编码权利要求1的酪氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江云，刘晓红，李家松，胡诚，周庆，张维，胡美荣，周娟作，江欢欢，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11