本发明专利技术公开了以构建的禽传染性支气管炎病毒H120反向遗传系统为基础，将禽新城疫病毒HN基因替换H120毒株5a基因（图1），获得R‑H120‑Lasota（HN）二联疫苗拯救毒株，该重组疫苗株能同时对IBV 标准攻毒毒株和新城疫标准攻毒毒株具有良好的保护作用，可用于预防禽传染性支气管炎病毒和禽新城疫病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物医药生物工程领域，是一种禽传染性支气管炎病毒H120重组表达禽新城疫病毒Lasota毒株HN基因疫苗。
技术介绍
禽传染性支气管炎病毒（IBV）引起的禽传染性支气管炎(IB)，是危害养禽业的重大传染病之一，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋下降30-50%、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。在我国该病发病率100%，死亡率10-30%，国内每年造成的经济损失超过十亿元。毒载体是利用重组DNA 技术将外源基因插入经过改造的病毒基因组内部，而后感染细胞，使外源基因在细胞内有效表达。病毒载体作为一种常用于分子生物学的工具多用于疫苗研究等方向。反向遗传技术的成熟，催生出了许多RNA 病毒载体，Zhao H等分别在NDV 强毒株、弱毒株的4个不同基因间插入外源基因，发现病毒的复制效率和滴度并没有受到明显的影响，证实NDV作为疫苗载体是完全可行的。2001通过反向遗传在新城疫病毒中重组表达禽流感血凝蛋白，发现所构建的重组的拯救病毒可以诱导对禽流感病毒强烈的体液抗体免疫反应对小鼠致死剂量禽流感病毒具有完全保护作用。Huang Z H等先后用重组NDV Lasota株表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白，对NDV强毒株和传染性法氏囊病毒超强毒株的攻击均能起到相当良好的保护。2007年Joshua M和PANS利用新城疫病毒做为载体表达SARS病毒S基因所构建的疫苗在对实验动物进行双倍剂量的SARS病毒接种，发现在病毒在肺部复制顶峰时期的含量要远远低于对照。2008年Man-Seong Park应用ND病毒载体表达禽流感H5、H9 血凝素基因构建为疫苗，发现不仅对新城疫具有致死性剂量的保护作用，同时对禽流感病毒同时具有良好的保护作用。2007哈兽研Ge等通过反向遗传手段将AIV H5N1 HA基因插入到NDV Lasota中，形成二联苗能够对同源或者异源的新城疫病毒、高致病性禽流感具有完全的免疫保护作用。
技术实现思路
本专利技术根据本实验室成功构建的禽传染性支气管炎病毒H120反向遗传系统为基础，将禽新城疫病毒HN基因替换H120毒株5a基因，获得R-H120-Lasota（HN）拯救毒株。附图说明图1：H120重组表达NDV HN基因构建策略图。具体实施方式1、本专利技术所用禽传染性支气管炎病毒H120毒株反向遗传系统为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室构建。使用的传代细胞BHK21为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存。PCR高保真酶，限制性内切酶BsaI，BsmB I，NciI，T4连接酶为购自NEB公司，PCR高保真酶， pMD-19T购自大连宝生物有限公司胶回收试剂盒购自TIANGEN 有限责任公司，引物设计和序列测定为英潍捷基公司完成。2、设计引物：设计引物扩增所改造的禽新城疫病毒HN基因，用以替换禽传染性支气管炎病毒H120毒株反向遗传系统中5a基因，构建策略见图1。3、RNA 提取：使用Trizol 法提取其Lasota毒株全基因组RNA，其过程为：取200 μL禽传染性支气管炎病毒液加750 μL TRIzol® Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)；混匀，15-30℃放置5 min，加200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min，4℃ 12000 rpm离心10 min，取上层水相，转入新的离心管中，缓慢加入1倍体积70%异丙醇，混匀，放置10-20 min，4℃ 12000 rpm离心30 s，弃废液；4℃ 12000 rpm离心2 min，去除残余液体。加入30μL RNase-free水，室温放置2 min，4℃ 12000 rpm离心2 min，收集离心后上清液，取5 μL于1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳。其它于-70 ℃保存备用。cDNA的合成，使用宝生物反转录试剂盒primeScripts，按照试剂盒说明进行，其反应体系Buffer 2 μL，oligdT 0.5 μL，radome 0.5 μL，RNA模板，37摄氏度15 min，85℃ 5 s。禽新城疫病毒HN基因PCR获取，以cDNA为模板，加入KOD plus polymerase (Toyobo, Japan)。聚合酶、上下游引物、dNTP进行扩增反应。PCR的反应体系为：10×buffer 5μL，4×dNTP mix（2.5 mmol/L）4 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各2 μL，Mgcl2 3 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 31.75 μL，0.25 μL。反应参数为：94℃ 5 min，25个循环，94℃ 30 s，60℃，30 s，72℃ 2 min 最后 72℃ 10 min。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增条带大小与预期的结果一致。PCR产物纯化，琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，通过使用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得纯化的禽新城疫病毒HN基因PCR片段。PCR片段的克隆，将纯化的禽新城疫病毒HN PCR片段与pMD-19T连接反应如下， PCR产物 4.5 μL，pMD-19T载体 0.5μL solutionⅠ 5 μL，混匀，16℃ 过夜，将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养16 h后，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，接种5 mL液体培养基中，37℃，进行培养，然后挑阳性菌液2-3个送上海生工进行测序，若比对分析结果序列与GenBank中一致，表明克隆成功。碱裂解法抽提质粒DNA，将所鉴定阳性克隆子大量培养，碱裂解法提取质粒。目的cDNA片段的酶切回收：对载有HN片段的质粒进行BsmB I酶切酶切体系为BsmB I：NEB buffer 3 5 μL，BSA（10mg/Ml）0.5 μL，BsmB I 2 μL，质粒20 μL，ddH2O 22.5 μL，总体系为50μL。55℃温育8 h。4、全长cDNA的体外构建使用已建立的禽传染性支气管炎病毒H120毒株反向遗传系统，重新连接改造后的全长cDNA。5、细胞适应性H120毒株cDNA的体外转录及恢复病毒的获得体外转录试剂盒进行转录：取约200 ng经纯化连接产物作为模板，使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit进行体外转录，反应体系如下：（1）全长cDNA体外转录体系：10×T7 Reaction Buffer 2 μL，T7 2×NTP/ARCA 10 μL，GTP 3 μL，Template DNA5 μL，T7 Enzyme Mix 2 μL，20 μL（2）N-3’cDNA体外转录体系：10×T7 Reaction Buffer 2 μL， T7 2×NTP/ARCA 10 μL，GTP 3 μL，Template DNA 5μL，T7 Enzyme Mix 2 μL37℃温育2 h后，加入1 μL TURBO DNase，温育15 min。-70℃保存。6、电击转染（1）将BHK细胞培养至单层时，用0.25%胰酶消化，加入8 mL DMEM完全培养基，悬浮细胞。4℃ 400 g离心3 min。弃上清，加入10 mL不含FBS、青链霉素的DMEM重悬细胞，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禽传染性支气管炎病毒H120重组表达禽新城疫病毒Lasota 毒株HN基因疫苗株构建技术，其特征在于：使用反向遗传技术，将禽传染性支气管炎病毒H120毒株对禽新城疫病毒Lasota毒株HN进行表达，构建以禽传染性支气管炎病毒H120为载体的二联苗株R‑H120‑Lasota（HN）。
【技术特征摘要】
1.一种禽传染性支气管炎病毒H120重组表达禽新城疫病毒Lasota 毒株HN基因疫苗株构建技术，其特征在于：使用反向遗传技术，将禽传染性支气管炎病毒H120毒株对禽新城疫病毒Lasota毒株HN进行表达，构建以禽传染性支气管炎病毒H120为载体的二联苗株R-H120-Lasota（HN）。2.根据权利要求1所述的R-H120-Lasota（HN）疫苗株，其特征在于：按照No see'M策略设计引物，在扩增HN 基因的上下游引物引入BsmBⅠ限制性内切酶，并在HN基因起始密码子ATG前面引入GeneEnd，Genestar，korzea“AGAAAAAATACGGGTAGAACACTAGTCCGCCACCA”，用所扩增的HN基因替换H120毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：王红宁，杨鑫，周泷，周英顺，门帅，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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