本发明专利技术提供了一种基于石墨烯和量子点的荧光共振能量转移传感器的构建及其对CaMV35S启动子的检测方法，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、氮硫同杂石墨烯量子点(NSGQDs)溶液的制备；步骤3、氮硫同杂石墨烯量子点‑捕获探针(NSGQDs‑ssDNA)分散液的制备；步骤4、荧光共振能量转移传感器的构建；步骤5、标准曲线的构建；步骤6、基于MWCNTs/GONRs‑NSGQDs‑ssDNA构建的FRET传感器对转基因大豆的检测。该方法具有FRET传感器所具有的操作简便灵活、分析速度快的特点，适用于快速检测分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于材料制备及荧光共振能量转移领域，特指一种基于石墨烯和量子点的荧光共振能量转移传感器的构建及其对CaMV35S启动子的检测方法。
技术介绍
转基因作物(Genetically Modified Organisms，简称GMOs)是指利用生物技术，把从动物、植物或微生物等生物体中经鉴定、分离的目的基因插入植物基因组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物。目前转基因检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条法和蛋白质芯片，聚合酶链式反应(PCR)法等。但是基于蛋白的检测方法背景信号高、蛋白质活性难以长久保持、开发特异性抗体的成本高、加工过的转基因产品其蛋白质发生变性而无法进行检测。基于RAN的检测收到RNA容易降解和对实验条件要求较高的限制，从而较难普及。而尽管PCR方法是高灵敏度的DNA水平检测方法，但是常伴有各种假性结果出现：一方面，DNA提取时产生的各种反应抑制因子，可能使PCR呈假阴性；另一方面，PCR过程中容易引入非特异性扩增，从而使PCR呈假阳性。此外，PCR样品需要量大，操作繁琐，检测时间长，还容易造成定量不准确等一系列问题。因此，发展一种非PCR扩增的快速检测方法成为GMO检测所追求的目标。石墨烯纳米带(Graphene Nanoribbons,GNRs)是最近被发现的又一种新型碳质纳米材料，其结构介于一维碳纳米管和二维石墨烯纳米片之间，被认为是拉长的石墨带，具有准一维蜂窝构型单层带状结构，以及优异的性能，如导电性较好、材料容易制备、表面含有大量的含氧官能团而容易功能化等，研究者们已初步将其应用于电子学、光学、磁学、生物医学、催化、传感器等诸多领域。石墨烯材料自身具有荧光性能，能够通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)来有效猝灭其他分子的荧光，传统的荧光能量转移速率由供体与受体距离(d)的负6次方决定，而石墨烯材料与荧光分子的荧光能量转移速率取决于d的负4次方，荧光淬灭效率更高。但是，石墨烯纳米片之间由于存在强烈的相互作用，易于重新堆砌成石墨，这给石墨烯的应用研究造成严重的障碍。通过选择合适的功能材料与其杂化，形成石墨烯杂化材料，不仅可以有效地阻止石墨烯纳米片的重新聚集，而且所制备的石墨烯杂化材料还可能会被赋予更加优异的物理化学性能[153]。最近的研究发现，通过将碳纳米管与石墨烯进行复合，所得到的MWCNTs/GONRs，不仅可以保持碳纳米 管良好的机械性能，而且可以有效增加石墨烯纳米片的层间距使其不易团聚，具有良好的分散性。量子点是一种新型荧光纳米材料，相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱窄而且不拖尾，因而，以量子点为给体的荧光共振能量转移，可减少给体与受体发射光谱的重叠；量子点的激发光谱范围较宽，当它作为能量给体时，可以更自由地选择激发波长，从而最大限度地避免对受体的直接激发；量子点的发射光谱可调，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量给体。所以，量子点应用于荧光共振能量转移的研究，已受到广大科研工作者的广泛关注。由于具有良好的化学惰性、生物相容性和较低的生物毒性，在生物成像、疾病检测、药物输送和光电器件应用领域中引起了极大关注。而氮、硫元素的参杂是一种对量子点性能调节非常有效的方法。氮硫同杂石墨烯量子点(NSGQDs)中通过化学键合N,S原子，可改变其性能，如提高荧光量子产率，提供更多的活性位点，其荧光性能明显增强等。NSGQDs具有稳定的荧光信号，其最佳激发光谱在350nm，而荧光发射光谱位于425nm处。NSGQDs和MWCNTs/GONRs分别作为FRET传感器的能量供体和受体。捕获探针DNA(ssDNA)末端修饰氨基，与NSGQDs的羧基通过酰胺反应，形成NSGQDs-ssDNA；通过DNA和NSGQDs与MWCNTs/GONRs的π-π叠加作用，使NSGQDs-ssDNA吸附于MWCNTs/GONRs表面，淬灭NSGQDs的荧光；当加入待检测目标DNA(tDNA)后，tDNA和ssDNA杂交互补配对，形成NSGQDs-dsDNA,从而把NSGQDs-ssDNA从MWCNTs/GONRs表面解离，从而使NSGQDs的荧光恢复。
技术实现思路
本专利技术旨在专利技术一种低毒、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的FRET方法，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的检测含有CaMV35S启动子转基因作物及产品的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。一种简单的荧光共振能量转移传感器检测GMO含量的方法：发出荧光信号的NSGQDs通过酰胺反应和捕获探针ssDNA结合，形成NSGQDs-ssDNA；通过DNA和NSGQDs与MWCNTs/GONRs的π-π叠加作用，使NSGQDs-ssDNA吸附于MWCNTs/GONRs表面，淬灭NSGQDs的荧光；当加入待检测目标DNA(tDNA)后，tDNA和ssDNA杂交互补配对，形成NSGQDs-dsDNA,从而把NSGQDs-ssDNA从MWCNTs/GONRs表面解离，从而使NSGQDs的荧光恢复。通过所恢复的荧光强度的测定，检测转基因大豆中是否含有CaMV35S启动子以区分转基因和非转基因大豆。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种基于石墨烯和量子点的荧光共振能量转移传感器的构建及其对CaMV35S启动子的检测方法，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、氮硫同杂石墨烯量子点(NSGQDs)溶液的制备；步骤3、氮硫同杂石墨烯量子点-捕获探针(NSGQDs-ssDNA)分散液的制备：取步骤2制备的氮硫同杂石墨烯量子点溶液超声分散，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，振荡均匀，加入捕获探针储备液；在室温下反应，得到氮硫同杂石墨烯量子点-捕获探针，记作NSGQDs-ssDNA，之后用乙醇洗涤，离心，最后将NSGQDs-ssDNA分散于Tris-HCl缓冲液中，得到NSGQDs-ssDNA分散液，备用；步骤4、荧光共振能量转移传感器的构建：将步骤1的MWCNTs/GONRs分散液加入到步骤3的NSGQDs-ssDNA分散液中，超声分散，静置后，测定MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA体系的荧光强度；步骤5、标准曲线的构建：将步骤1的MWCNTs/GONRs分散液加入到步骤3的NSGQDs-ssDNA分散液中，超声分散，静置后，测定MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA体系的荧光强度，随后加入不同浓度的目标DNA，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；步骤6、基于MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA构建的FRET传感器对转基因大豆的检测：采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA；之后将转基因大豆的DNA加入到MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA FRET传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有CaMV35S启动子的结论。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于石墨烯和量子点的荧光共振能量转移传感器的构建及其对CaMV35S启动子的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、氮硫同杂石墨烯量子点溶液的制备；步骤3、氮硫同杂石墨烯量子点‑捕获探针分散液的制备：取步骤2制备的氮硫同杂石墨烯量子点溶液超声分散，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入捕获探针储备液；在室温下反应，得到氮硫同杂石墨烯量子点‑捕获探针，记作NSGQDs‑ssDNA，之后用乙醇洗涤，离心，最后将NSGQDs‑ssDNA分散于Tris‑HCl缓冲液中，得到NSGQDs‑ssDNA分散液，备用；步骤4、荧光共振能量转移传感器的构建：将步骤1的MWCNTs/GONRs分散液加入到步骤3的NSGQDs‑ssDNA分散液中，超声分散，静置后，测定MWCNTs/GONRs‑NSGQDs‑ssDNA体系的荧光强度；步骤5、标准曲线的构建：将步骤1的MWCNTs/GONRs分散液加入到步骤3的NSGQDs‑ssDNA分散液中，超声分散，静置后，测定MWCNTs/GONRs‑NSGQDs‑ssDNA体系的荧光强度，随后加入不同浓度的目标DNA，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；步骤6、基于MWCNTs/GONRs‑NSGQDs‑ssDNA构建的FRET传感器对转基因大豆的检测：采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA；之后将转基因大豆的DNA加入到MWCNTs/GONRs‑NSGQDs‑ssDNA FRET传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有CaMV35S启动子的结论。...
【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯和量子点的荧光共振能量转移传感器的构建及其对CaMV35S启动子的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、氮硫同杂石墨烯量子点溶液的制备；步骤3、氮硫同杂石墨烯量子点-捕获探针分散液的制备：取步骤2制备的氮硫同杂石墨烯量子点溶液超声分散，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入捕获探针储备液；在室温下反应，得到氮硫同杂石墨烯量子点-捕获探针，记作NSGQDs-ssDNA，之后用乙醇洗涤，离心，最后将NSGQDs-ssDNA分散于Tris-HCl缓冲液中，得到NSGQDs-ssDNA分散液，备用；步骤4、荧光共振能量转移传感器的构建：将步骤1的MWCNTs/GONRs分散液加入到步骤3的NSGQDs-ssDNA分散液中，超声分散，静置后，测定MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA体系的荧光强度；步骤5、标准曲线的构建：将步骤1的MWCNTs/GONRs分散液加入到步骤3的NSGQDs-ssDNA分散液中，超声分散，静置后，测定MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA体系的荧光强度，随后加入不同浓度的目标DNA，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；步骤6、基于MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA构建的FRET传感器对转基因大豆的检测：采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA；之后将转基因大豆的DNA加入到MWCNTs/GONRs-NSGQDs-ssDNA FRET传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有CaMV35S启动子的结论。2.根据权利要求1所述的一种基于石墨烯和量子点的荧光共振能量转移传感器的构建及其对CaMV35S启动子的检测方法，其特征在于，步骤3中，所使用的氮硫同杂石墨烯量子点溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基...
【专利技术属性】
技术研发人员：李雅琪，王坤，蔡健荣，孙力，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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